חקירה של סינתזת RNA באמצעות Labelling 5-Bromouridine ו- Immunoprecipitation
Summary
בשיטה זו ניתן למדוד את סינתזת RNA. 5-Bromouridine הוסיף לתאים, שולבו RNA מסונתז. סינתזת RNA נמדד על ידי RNA חילוץ מיד לאחר labelling, ואחריו immunoprecipitation 5-Bromouridine-ממוקד של RNA וניתוח עם תוויות ברורות על ידי שעתוק במהופך ואת תגובת שרשרת פולימראזית כמותית.
Abstract
כאשר רמות מצב יציב RNA מושווים בין שני תנאים, אין אפשרות להבחין בין אם השינויים נגרמים שינויים ייצור או השפלה של RNA. פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת ייצור RNA, באמצעות 5-Bromouridine תוויות של RNA ואחריו immunoprecipitation, אשר מאפשר חקירה של RNA מסונתז בתוך פרק זמן קצר (למשל, 1 h). היתרון של immunoprecipitation ו- 5-Bromouridine-תוויות על השימוש של מעכבי תעתיק רעילים, כגון אמניטין α וואקטינומיצין D, היא שאין שום או אפקטים נמוך מאוד על יכולת הקיום תא במהלך שימוש לטווח קצר. עם זאת, כי 5-Bromouridine-immunoprecipitation רק לוכד RNA שהופק במסגרת הזמן labelling קצר, לאט המיוצר וכן במהירות השפיל RNA יכול להיות קשה למדוד בשיטה זו. ניתן לנתח את הרנ א. 5-Bromouridine-מתויג שנתפסו על ידי 5-Bromouridine-immunoprecipitation על ידי שעתוק במהופך, כמותית של תגובת שרשרת פולימראזית רצף הדור הבא. כל סוגי RNA יכול ייחקרו, השיטה אינה מוגבלת מדידה mRNA כפי מוצג בדוגמה זו.
Introduction
5-Bromouridine (אחי) immunoprecipitation (IP) מאפשר חקר ייצור RNA בתאים ללא או השפעות מוגבלת מאוד על תא פיזיולוגיה במהלך התקציר labelling תקופה1,2. השיטה מבוססת על התאגדות של הנגזרת uridine סינתטי ברו לתוך RNA מסונתז לאחרונה עקב על ידי ה-IP של RNA שכותרתה באמצעות נוגדנים anti-ברו (איור 1).
זה כבר ידוע כי עשרות שנים את סינתזת החלבון להיות מוסדרות transcriptionally, קיום גורמי שעתוק היה שיערו לפני יותר מ 50 שנה3. כיום, ידוע כי כמה מחלות נגרמות על ידי dysregulation של שעתוק ויציבות RNA (משלים איור S1 הפניה4), ואת היכולת למדוד שינויים בייצור ה-RNA הוא בעל חשיבות רבה הבנה במחלה פיתוח.
מצד שני, כלי כדי לווסת את ייצור RNA מספקים אפשרויות חדשות לטיפול במחלות שנגרמו על ידי ביטוי חלבון קטן מדי או גדול מדי, או הצטברות חלבונים כגון מחלת פרקינסון (PD). החלבון השולט צבירת אגרגטים מסיסים כמו ב- PD α-synuclein, הרמה של α-synuclein מקושר ישירות המחלה, כמו ג’ין הכפלה של הגן α-synuclein גורמת PD משפחתית5. יתר על כן, α-synuclein אגרגטים באופן תלוי ריכוז. Downregulation של רמות ה-mRNA α-synuclein לכן אסטרטגיה טיפולית מעניינת, אשר בהצלחה הושגה באמצעות התערבות RNA כדי להקטין את איבוד תאים עצביים ב- PD מודלים מכרסמים6,7.
חשוב שניתן יהיה למדוד את השינויים בתחום ייצור RNA נגרם על-ידי מחלה או התערבויות טיפוליות. המדינה של אמנות שיטות מדידת רמות מצב יציב של RNA, כגון שעתוק במהופך ואחריו תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (RT-qPCR), אינם מסוגלים להבחין בין השינויים שנגרמו על ידי רגולציה תעתיק או משתנה יציבות הרנ א. שיטה בשימוש נרחב לחקירה של RNA הניוון חוסם של מכונות תעתיק באמצעות תרכובות כגון אמניטין α או ואקטינומיצין D ואחריו מדידות RNAs רקובה. עם זאת, ישנם כמה בעיות הקשורות של חסימה הכוללת של שעתוק בתאים, כגון אינדוקציה של אפופטוזיס8,9. לצד ההשפעות ציטוטוקסיות, מעכבי תעתיק גם להציג מספר בעיות טכניות, כגון ספיגת הסלולר איטי של α אמניטין וחוסר יחודיות של ואקטינומיצין D (נבדקה תוך התייחסות10).
כדי למנוע את החסימה הכללי של שעתוק, נוקלאוטיד מקבילים היו בשימוש, כגון 5-ethynyl uridine (5-האיחוד האירופי), 4-thiouridine (4-טו) וברו. אלה בקלות נלקח על ידי בתרבית של תאים, שולבו לאחרונה מסונתז RNA, הפעלת הדופק-תוויות של RNA בתוך פרק זמן מסוים. ברו רעיל פחות מ 5-האיחוד האירופי, 4-טו, הפיכתה של אנלוגי המועדפת של הבחירה11,12.
ברו-IP יכול לשמש כדי לחקור את קצב סינתזת RNA ויציבות, וכך להבדיל בין הגורמים הבסיסיים של שינויים ב- RNA הכולל. מאמר זה יתמקד המידה של סינתזת RNA ומתייחס להפנות2 פרטים על החקירה של יציבות הרנ א. לחקור סינתזה RNA, התאים הם בקצרה בלוחיות ברו למשל עבור h 1 ואחריו ברו-IP1 (איור 1C). דבר זה מאפשר מדידות של RNA מסונתז בתוך זמן קצר labelling וייתן שינויי אומדן טוב יותר של תקנות ב סינתזה RNA מאשר על ידי מדידת שינויים ב- RNA הכולל מאת RT-qPCR. יש לציין, עם זאת, כי למרות הזמן labelling הוא, לדוגמה, רק 1 h, השפלה יכולים עדיין יש השפעה על רמות ה-RNA שנצפו.
RNA של ברו-IP ניסויים מתאימים לניתוח במורד הזרם על ידי שני RT-qPCR1 או2,רצף הדור הבא13. תקן RNA לזיהוי בשיטות אחרות, כגון סופג בצפון או ribonuclease הגנה assay, עשוי גם להיות ישימים עבור RNAs מסוימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש ברו-IP עבור נחישות של RNA הייצור על ידי תוויות של לאחרונה לייצור RNA 1 h עם ברו, ואחריו פינוי מיידי של RNA ו- immunoprecipitation של RNA מתויג ברו. שיטה זו שתיארנו קודם לכן ההפניה16, מאמר זה מכיל שלבים נוספים להגברת IP ירידה לפרטים וטוהר RNA, על ידי חרוזים מראש לטיפול עם ריכו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
קרן לונדבק, אוניברסיטת ארהוס, Dandrite, לונדבק יצוק תמיכה עבודה זו.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
