Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation
Summary
Diese Methode kann verwendet werden, um RNS-Synthese zu messen. 5-Bromouridine Zellen hinzugefügt und synthetisierte RNA eingebaut. RNA-Synthese wird durch RNA-Extraktion unmittelbar nach der Kennzeichnung, gemessen, gefolgt von 5-Bromouridine-gezielte Immunopräzipitation gekennzeichneten RNA und Analyse durch reverse Transkription und quantitative Polymerase-Kettenreaktion.
Abstract
Wenn Steady-State RNA-Ebene zwischen zwei Bedingungen verglichen werden, ist es nicht möglich zu unterscheiden, ob Änderungen durch Veränderungen in der Produktion oder Abbau der RNA entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Messung der RNA-Produktion, mit 5-Bromouridine Kennzeichnung von RNA, gefolgt von Immunopräzipitation, die Untersuchung der RNA synthetisiert innerhalb eines kurzen Zeitraums (z.B. 1 h) ermöglicht. Der Vorteil von 5-Bromouridine-Kennzeichnung und Immunopräzipitation über die Verwendung von giftigen transcriptional Hemmer wie α-Amanitin und Actinomycin D ist, dass es keine oder sehr geringe Auswirkungen auf die Zellviabilität bei kurzfristigen Einsatz. Da 5-Bromouridine-Immunopräzipitation nur RNA produziert innerhalb der kurzen Kennzeichnung Zeit erfasst, langsam erzeugt sowie schneller abgebaut kann RNA jedoch schwierig, mit dieser Methode zu messen sein. Die 5-Bromouridine-gekennzeichnete RNA durch 5-Bromouridine-Immunopräzipitation erfasst kann durch reverse Transkription, quantitative Polymerase-Kettenreaktion und Sequenzierung der nächsten Generation analysiert werden. Alle Arten von RNA untersucht werden können, und die Methode beschränkt sich nicht auf mRNA zu messen, wie in diesem Beispiel dargestellt wird.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) Immunopräzipitation (IP) ermöglicht die Untersuchung der RNA-Produktion in Zellen ohne oder sehr begrenzte Auswirkungen auf die Zelle Physiologie während der kurzen Periode1,2Kennzeichnung. Die Methode basiert auf Einbeziehung der synthetischen Uridin Ableitung BrU in neu synthetisierte RNA gefolgt von IP-Adresse des gekennzeichneten RNA mit Anti-BrU-Antikörpern (Abbildung 1).
Es ist bekannt für Jahrzehnte die Proteinsynthese transcriptionally geregelt werden kann, und die Existenz von Transkriptionsfaktoren wurde vor mehr als 50 Jahren die Hypothese3. Heute ist bekannt, dass verschiedene Krankheiten durch Dysregulation der Transkription und der Stabilität der RNA entstehen (ergänzende Abbildung S1 in Referenz4), und die Fähigkeit, Veränderungen in der Produktion von RNA zu messen ist von großer Bedeutung im Verständnis der Krankheit Entwicklung.
Auf der anderen Seite bieten Werkzeuge, RNA-Produktion zu regulieren neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krankheiten, die durch zu wenig oder zu viel Protein-Expression oder Protein Akkumulation wie z. B. bei Morbus Parkinson (PD). Das vorherrschende Protein akkumulieren als unlösliche Aggregate in PD ist α-Synuclein und das Niveau der α-Synuclein knüpft direkt an die Krankheit, wie gen-Multiplikation des α-Synuclein Gens familiäre PD5verursacht. Darüber hinaus sammelt α-Synuclein in gewissem Sinne Konzentration abhängig. Herabregulation von α-Synuclein-mRNA-Niveaus ist daher eine interessante therapeutische Strategie, die erfolgreich erreicht worden ist, mit RNA-Interferenz, um neuronaler Zellverlust im PD Nager-Modelle6,7zu verringern.
Es ist wichtig, um Änderungen in der RNA Produktion verursacht durch Krankheit oder therapeutische Interventionen zu messen können. Modernste Methoden verändert für Steady-State Messhöhen RNA, wie reverse Transkription, gefolgt von quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR), nicht in der Lage sind, die Unterscheidung zwischen Änderungen durch transcriptional Regelung oder RNA-Stabilität. Eine weit verbreitete Methode zur Untersuchung der RNA Zerfall Sätze blockiert der transkriptionellen Maschinen mit Verbindungen wie α-Amanitin oder Actinomycin D gefolgt von Messungen der verfallenden RNAs. Allerdings gibt es einige Probleme im Zusammenhang mit einer allgemeinen Blockade der Transkription in Zellen, wie Induktion der Apoptose8,9. Neben der zytotoxischen Effekte präsentieren transcriptional Hemmer auch mehrere technische Probleme wie langsame zelluläre Aufnahme von α-Amanitin und mangelnde Spezifität von Actinomycin D (rezensiert in Referenz10).
Um die allgemeine Blockierung der Transkription zu vermeiden, wurden Nukleotidanaloga verwendet, z. B. 5-Ethynyl Uridin (5-EU) und 4-Thiouridine (4-TU) BrU. Diese sind leicht von Säugerzellen aufgegriffen und integriert neu synthetisierte RNA ermöglichen, Puls-Kennzeichnung von RNA innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. BrU ist weniger toxisch als EU-5- und 4-TU, so dass es die bevorzugte Analogon zur Wahl11,12.
BrU-IP kann verwendet werden, zu untersuchen, die bei RNA-Synthese und Stabilität, und somit zu unterscheiden zwischen den zugrunde liegenden Ursachen der Veränderungen im Gesamt-RNS. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Messung der RNA-Synthese und bezieht sich auf2 für Details zur Untersuchung der Stabilität der RNA um zu verweisen. Um RNA-Synthese zu untersuchen, werden Zellen kurz mit BrU z.B. für 1 h, gefolgt von BrU-IP-1 (Abbildung 1) gekennzeichnet. Dies ermöglicht Messungen der RNA synthetisiert innerhalb der kurzen Zeit der Kennzeichnung und beobachtete Veränderungen geben eine bessere Schätzung der Vorschriften in der RNA-Synthese als durch die Messung von Veränderungen im gesamten RNA durch RT-qPCR. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass obwohl die Kennzeichnung, z. B. nur 1 h dauert Abbau noch einen Einfluss auf die RNA-Ebenen beobachtet haben kann.
RNS von BrU-IP-Experimente eignen sich für nachgelagerte Analyse von RT-qPCR1 oder nächste Generation Sequenzierung2,13. Andere standard RNA Nachweisverfahren, wie Nordbeflecken oder Ribonuklease-Protection-Assay können auch für bestimmte RNAs gelten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz des BrU-IP für Bestimmung der RNA-Produktion durch Kennzeichnung von neu RNA für 1 h mit BrU produzierten, gefolgt von sofortige RNA-Extraktion und Immunopräzipitation BrU gekennzeichnet RNA. Diese Methode ist bisher in Referenz16beschrieben worden, und dieser Artikel enthält einige zusätzliche Schritte, um IP-Spezifität und RNA Reinheit, von Pre-Behandlung von Perlen mit niedrigen Konzentrationen von BrU sowie eine Phenol-Chloroform Reinigungsstufe zu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Lundbeck-Stiftung, Universität Aarhus, Dandrite und Lundbeck a/s unterstützt diese Arbeit.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
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