Enquête de synthèse de l’ARN à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage et immunoprécipitation
Summary
Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la synthèse de l’ARN. 5-Bromouridine est ajouté aux cellules et incorporé dans l’ARN synthétisé. Synthèse de l’ARN est mesurée par l’extraction de l’ARN immédiatement après marquage, suivi par immunoprécipitation 5-Bromouridine-ciblées d’étiquetés RNA et analyse par transcription inverse et la PCR quantitative.
Abstract
Lorsque les niveaux de l’état stationnaire RNA sont comparées entre deux conditions, il n’est pas possible de distinguer si les changements sont causés par des modifications de la production ou la dégradation de l’ARN. Ce protocole décrit une méthode pour la mesure de la production d’ARN, à l’aide de 5-Bromouridine étiquetage d’ARN suivie d’immunoprécipitation, qui permet l’investigation de l’ARN synthétisé dans un court délai (par exemple, 1 h). L’avantage de 5-Bromouridine-étiquetage et immunoprécipitation sur l’utilisation d’inhibiteurs de transcriptional toxiques, tels que le α-amanitine et l’actinomycine D, est qu’il n’y aucune ou très peu d’effets sur la viabilité cellulaire lors d’une utilisation à court terme. Cependant, parce que le 5-Bromouridine-immunoprécipitation capte seulement RNA produites dans le court délai d’étiquetage, produit lentement comme rapidement dégradés RNA peut être difficile à mesurer par cette méthode. L’ARN 5-Bromouridine-marqué capturé par 5-Bromouridine-immunoprécipitation peut être analysé par transcription inverse, quantitative PCR et séquençage de la génération suivant. Tous les types d’ARN peuvent être l’objet d’une enquête, et la méthode n’est pas limitée à la mesure des ARNm est présenté dans cet exemple.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprécipitation (IP) permet l’étude de la production d’ARN dans les cellules avec no ou des effets très limités sur cellulaire physiologie au cours de la brève période1,2d’étiquetage. La méthode repose sur l’incorporation du dérivé synthétique de l’uridine BrU en ARN nouvellement synthétisé suivi par IP d’ARN marqué à l’aide d’anticorps anti-BrU (Figure 1).
On sait depuis des décennies que la synthèse de protéine peut être réglée de transcription, et l’existence de facteurs de transcription a émis l’hypothèse il y a plus de 50 ans3. Aujourd’hui, on sait que plusieurs maladies sont causées par le dérèglement de la transcription et de la stabilité de la RNA (complémentaire Figure S1 en référence4), et la capacité à mesurer les changements dans la production d’ARN est d’une grande importance dans la maladie de compréhension développement.
En revanche, outils pour réguler la production d’ARN fournissent de nouvelles possibilités pour le traitement de maladies causées par l’expression de protéines trop ou trop peu, ou l’accumulation de protéine comme dans la maladie de Parkinson (MP). La protéine prédominante, accumulant des agrégats comme insolubles dans PD est α-synucléine, et le niveau de la synucléine α est directement lié à la maladie, comme des causes de multiplication de gène du gène α-synucléine familial PD5. Par ailleurs, α-synucléine regroupe de manière dépendante de la concentration. Diminution de l’expression des ARNm de la synucléine α est donc une stratégie thérapeutique intéressante, qui a été réalisée avec succès à l’aide de l’interférence ARN pour diminuer la perte des neurones dans PD modèles rongeurs6,7.
Il est important de pouvoir mesurer les changements dans la production d’ARN causée par une maladie ou des interventions thérapeutiques. Méthodes de pointe pour mesurant les niveaux d’ARN, l’état stationnaire comme transcription inverse suivie par quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), ne sont pas capables de distinguer les changements causés par la régulation de la transcription ou altérés Stabilité de RNA. Une méthode largement utilisée pour l’étude des taux de décomposition de RNA n’entrave de la machinerie transcriptionnelle utilisant des composés tels que le α-amanitine ou l’actinomycine D, suivie par des mesures de l’ARN en décomposition. Cependant, il y a certains problèmes liés à un blocage général de transcription dans des cellules, telles que l’induction de l’apoptose8,9. À côté des effets cytotoxiques, inhibiteurs de la transcriptionnelles présentent également de nombreux problèmes techniques, comme la lente absorption cellulaire de le α-amanitine et le manque de spécificité de l’actinomycine D (revu en référence10).
Pour éviter le blocage total de la transcription, analogues nucléotidiques ont été utilisées, comme 5-éthynyl uridine (UE 5), 4-thiouridine (TU-4) et BrU. Ceux-ci sont facilement absorbés par les cellules de mammifères et incorporés dans l’ARN nouvellement synthétisé, permettant pouls-étiquetage de l’ARN dans un délai spécifique. BrU est moins toxique que l’UE 5 et 4-TU, ce qui en fait le préféré analogique de choix11,12.
BrU-IP peut servir à enquêter sur les deux le taux de synthèse d’ARN et de la stabilité et donc distinguer les causes des changements dans l’ARN total. Cet article se concentrera sur la mesure de la synthèse d’ARN et se réfère pour faire référence à2 pour plus de détails sur l’étude de stabilité de RNA. Pour étudier la synthèse de l’ARN, les cellules sont brièvement étiquetés avec BrU par exemple pendant 1 h puis BrU-IP1 (Figure 1). Ceci permet des mesures de l’ARN synthétisé dans le court délai d’étiquetage et les changements observés donnera une meilleure estimation des règlements dans la synthèse de l’ARN qu’en mesurant les changements dans l’ARN total par RT-qPCR. Il convient de mentionner, toutefois, que même si le temps d’étiquetage est, par exemple, seulement 1 h, dégradation peut avoir encore une influence sur les niveaux d’ARN observés.
L’ARN à partir des expériences de BrU-IP ne conviennent pas pour analyse en aval par les deux RT-qPCR1 ou prochaine génération séquençage2,13. Autres méthodes de détection RNA standards, tels que le transfert de Northern ou dosage de ribonucléase de protection, peuvent également s’appliquer pour certains ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit l’utilisation de BrU-IP pour la détermination de la production d’ARN par étiquetage des nouvellement produites RNA pendant 1 h avec BrU, suivie d’extraction de l’ARN immédiate et immunoprécipitation d’ARN marqué BrU. Cette méthode a déjà été décrit dans référence16, et cet article comprend quelques étapes supplémentaires pour augmenter la spécificité de la propriété intellectuelle et de la pureté de RNA, par prétraitement des billes avec de faibl…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fondation de Lundbeck, Université d’Aarhus, Dandrite et Lundbeck a/s pris en charge ce travail.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
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