Undersøgelse af RNA syntese ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning og Immunoprecipitation
Summary
Denne metode kan bruges til at måle RNA syntese. 5-Bromouridine er føjet til celler og indarbejdet i syntetisk RNA. RNA syntese er målt af RNA udvinding umiddelbart efter mærkning, efterfulgt af 5-Bromouridine-målrettet immunoprecipitation af mærket RNA og analyse af reverse transkription og kvantitative polymerase kædereaktion.
Abstract
Når steady state RNA niveauer sammenlignes mellem to betingelser, er det ikke muligt at skelne mellem om ændringer, der skyldes ændringer i produktionen eller nedbrydning af RNA. Denne protokol beskriver en metode til måling af RNA produktion, ved hjælp af 5-Bromouridine mærkning af RNA efterfulgt af immunoprecipitation, som giver mulighed for undersøgelse af RNA syntetiseret inden for en kort tidshorisont (fx, 1 h). Fordelen ved 5-Bromouridine-mærkning og immunoprecipitation over brugen af giftige transcriptional hæmmere, såsom α-amanitin og actinomycin D, er, at der er ingen eller meget lav effekter på celle levedygtighed under kortvarig brug. Men, fordi 5-Bromouridine-immunoprecipitation kun fanger RNA produceret inden for den korte tid, mærkning, langsomt produceret samt hurtigt nedbrudt RNA kan være vanskeligt at måle ved denne metode. Den 5-Bromouridine-mærket RNA fanget af 5-Bromouridine-immunoprecipitation kan analyseres ved reverse transkription, kvantitative polymerase kædereaktion og næste generation sequencing. Alle typer af RNA kan blive undersøgt, og metoden er ikke begrænset til måling mRNA, som præsenteres i dette eksempel.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) immunoprecipitation (IP) giver mulighed for undersøgelse af RNA produktion i celler med ingen eller meget begrænset indvirkning på celle fysiologi under den korte mærkning periode1,2. Metoden er baseret på inkorporering af den syntetiske uridine afledte BrU i nyligt syntetiserede RNA efterfulgt af IP af mærket RNA ved hjælp af anti-BrU antistoffer (figur 1).
Det har været kendt i årtier at proteinsyntesen transcriptionally kan reguleres, og eksistensen af transkriptionsfaktorer var hypotese mere end 50 år siden3. I dag, er det kendt, at flere sygdomme er forårsaget af dysregulering af transskription og RNA stabilitet (supplerende figur S1 i reference4), og evnen til at måle ændringer i RNA produktion er af stor betydning i forståelse sygdom udvikling.
På den anden side giver værktøjer til at regulere RNA produktion nye muligheder for behandling af sygdomme forårsaget af for lidt eller for meget protein udtryk eller protein akkumulering som i Parkinsons sygdom (PD). Den fremherskende protein akkumulere så uopløselige aggregater i PD er α-synuclein, og niveauet af α-synuclein er direkte forbundet med sygdommen, da genet multiplikation af α-synuclein genet forårsager familiær PD5. Desuden aggregater α-synuclein i en koncentration afhænger af måde. Downregulation af α-synuclein mRNA niveauer er derfor en interessant terapeutisk strategi, der er opnået med succes ved hjælp af RNA-interferens for at mindske neuronal celletab i PD gnavere modeller6,7.
Det er vigtigt at være i stand til at måle ændringer i RNA produktion forårsaget af enten sygdom eller terapeutiske indgreb. State of the art metoder ændret for måling steady state niveauer af RNA, som reverse transkription efterfulgt af kvantitative Polymerasekædereaktionen (RT-qPCR), ikke er i stand til at skelne mellem ændringer forårsaget af transkriptionel regulering eller RNA stabilitet. En udbredt metode til undersøgelse af RNA henfald satser blokering af transcriptional maskinen ved hjælp af forbindelser såsom α-amanitin eller actinomycin D efterfulgt af målinger af de rådnende RNA’er. Men der er nogle problemer i forbindelse med en generel blokering af transkription i celler, såsom induktion af apoptose8,9. Ved siden af de cytotoksiske virkninger præsentere transcriptional hæmmere også flere tekniske spørgsmål, såsom langsom cellulære optagelse af α-amanitin og manglende specificitet af actinomycin D (gennemgik i reference10).
For at undgå den samlede blokering af transskription, har været brugt nukleotid analoger, som 5-ethynyl uridine (5-EU), 4-thiouridine (4-TU) og BrU. Disse er let tages op af pattedyrceller og indarbejdet i nyligt syntetiserede RNA, aktivering af puls-mærkning af RNA inden for en bestemt tidsramme. BrU er mindre giftigt end 5-EU og 4-TU, hvilket gør det til det foretrukne analoge valg11,12.
BrU-IP kan bruges til at undersøge både antallet af RNA syntese og stabilitet, og således skelne mellem de underliggende årsager til ændringer i total RNA. Denne artikel vil fokusere på måling af RNA syntese og refererer til at referere til2 for nærmere oplysninger om undersøgelsen af RNA stabilitet. For at undersøge RNA syntese, er celler kort mærket med BrU fx for 1 h efterfulgt af BrU-IP1 (figur 1 c). Dette giver mulighed for målinger af RNA syntetiseret inden for den korte tid, mærkning og observerede ændringer vil give et bedre skøn over forordninger i RNA syntese end ved at måle ændringer i total RNA af RT-qPCR. Det skal bemærkes, at selv om mærkning tiden er for eksempel kun 1 h, nedbrydning kan stadig have indflydelse på RNA niveauer overholdes.
RNA fra BrU-IP eksperimenter er egnet til downstream analyse af både RT-qPCR1 eller næste generation sequencing2,13. Andre standard RNA påvisningsmetoder, såsom nordlige blotting eller ribonuklease beskyttelse assay, kan også være gældende for visse RNA’er.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver brugen af BrU-IP for bestemmelse af RNA produktion af mærkning af nyligt produceret RNA for 1 h med BrU, efterfulgt af umiddelbar RNA udvinding og immunoprecipitation af BrU-mærket RNA. Denne metode er tidligere blevet beskrevet i reference16, og denne artikel indeholder nogle ekstra trin for at øge IP specificitet og RNA renhed, af pre behandling af perler med lave koncentrationer af BrU samt et phenol-chloroform rensning skridt til øge RNA renhed efter Undersøgelses…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundbeckfonden, Aarhus Universitet, Dandrite og Lundbeck A/S støttet dette arbejde.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
