التحقيق في توليف الحمض النووي الريبي استخدام الوسم 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن
Summary
يمكن استخدام هذا الأسلوب لقياس توليف الحمض النووي الريبي. 5-بروموريديني هو إضافة إلى الخلايا وإدماجها في الجيش الملكي النيبالي تجميعي. توليف الحمض النووي الريبي يقاس باستخراج الحمض النووي الريبي فورا بعد وضع العلامات، تليها إيمونوبريسيبيتيشن 5-بروموريديني-استهدفت توسم الجيش الملكي النيبالي والتحليل بالنسخ العكسي والكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل.
Abstract
عند مستويات الدولة ثابت الحمض النووي الريبي مقارنة بين هذين الشرطين، من غير الممكن التمييز بين ما إذا كانت التغييرات هي الناجمة عن التغييرات في الإنتاج أو تدهور للجيش الملكي النيبالي. ويصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس إنتاج الحمض النووي الريبي، استخدام 5-بروموريديني وسم الحمض النووي الريبي يليه إيمونوبريسيبيتيشن، الذي يتيح التحقيق في الجيش الملكي النيبالي توليفها في إطار زمني قصير (مثلاً، ح 1). ميزة وضع العلامات 5-بروموريديني وإيمونوبريسيبيتيشن على استعمال مثبطات النسخي السامة، مثل α-أمانيتين ووالاكيتنوميسين د، أن هناك لا أو تأثيرات منخفضة جداً على بقاء الخلية أثناء الاستخدام القصير الأجل. بيد لأن 5-بروموريديني-إيمونوبريسيبيتيشن فقط يلتقط الجيش الملكي النيبالي المنتجة في الوقت القصير التوسيم، أنتجت ببطء، فضلا عن سرعة التدهور يمكن أن الحمض النووي الريبي يصعب قياسه بهذه الطريقة. يمكن تحليل استولت عليها 5-بروموريديني-إيمونوبريسيبيتيشن الجيش الملكي النيبالي 5-بروموريديني-المسمى بالنسخ العكسي والكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتسلسل الجيل القادم. يمكن أن يحقق في جميع أنواع من الحمض النووي الريبي، والأسلوب الذي لا يقتصر على قياس مرناً كما يرد في هذا المثال.
Introduction
5-بروموريديني (BrU) إيمونوبريسيبيتيشن (IP) يتيح دراسة إنتاج الحمض النووي الريبي في الخلايا التي تحتوي على لا أو آثار محدودة للغاية على خلية علم وظائف الأعضاء خلال الموجز وسمها الفترة1،2. الأسلوب الذي يستند إلى إدماج مشتقة أردين الاصطناعية يتبع BrU في الحمض النووي الريبي المركبة حديثا بالملكية الفكرية من الحمض النووي الريبي توسم باستخدام الأجسام المضادة-BrU (الشكل 1).
كما كان من المعروف لعقود يمكن أن ينظم هذا البروتين ترانسكريبتيونالي، وكان الافتراض بوجود عوامل النسخ قبل أكثر من 50 عاماً3. اليوم، أنه من المعروف أن العديد من الأمراض تسببها التقلبات من النسخ واستقرار الجيش الملكي النيبالي (S1 الشكل التكميلية في المرجع4)، والقدرة على قياس التغيرات في إنتاج الحمض النووي الريبي لها أهمية كبيرة في فهم الأمراض التنمية.
من ناحية أخرى، توفر أدوات لتنظيم إنتاج الحمض النووي الريبي إمكانيات جديدة لعلاج الأمراض الناجمة عن تعبير البروتين القليل أو الكثير، أو تراكم البروتين كما هو الحال في مرض باركنسون (PD). البروتين السائد تراكم المجاميع غير قابلة للذوبان كما في PD α-سينوكلين، ومستوى α-سينوكلين يرتبط ارتباطاً مباشرا بهذا المرض، كما تضاعف الجين الجينات α-سينوكلين الأسباب الأسرية PD5. وعلاوة على ذلك، المجاميع α-سينوكلين بطريقة تعتمد تركيز. ولذلك Downregulation مستويات مرناً α-سينوكلين هو استراتيجية علاجية مثيرة لاهتمام، وقد تحقق بنجاح باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل لتقليل فقدان الخلايا العصبية في PD نماذج القوارض6،7.
من المهم أن تكون قادرة على قياس التغيرات في إنتاج الحمض النووي الريبي الناجمة عن المرض أو التدخلات العلاجية. أحدث أساليب لقياس مستويات حالة ثابتة من الجيش الملكي النيبالي، مثل النسخ العكسي متبوعاً بالكمية البلمرة المتسلسل (RT-qPCR)، ليست قادرة على التمييز بين التغيرات الناجمة عن طريق تنظيم النسخي أو تغييرها الجيش الملكي النيبالي الاستقرار. يتم حظر أسلوب مستخدمة على نطاق واسع لتحقيق معدلات تحلل الحمض النووي الريبي إليه النسخي استخدام المركبات مثل α-أمانيتين أو والاكيتنوميسين د متبوعاً بإجراء قياسات للكشف المتحللة. ومع ذلك، هناك بعض المشاكل المرتبطة انسداد الكلي للنسخ في الخلايا، مثل تنظيم دورات تعريفية للمبرمج8،9. بجانب الآثار السامة للخلايا، هذه الموانع النسخي أيضا العديد من المسائل التقنية، مثل بطء امتصاص الخلوية من α-أمانيتين وعدم التحديد والاكيتنوميسين د (استعرض في المرجع10).
لتجنب انسداد الكلي للنسخ، استخدمت نظائر النوكليوتيدات، مثل أردين 5-اثينيل (5-الاتحاد الأوروبي)، 4-ثيوريديني (4-تو) و BrU. هذه هي سهولة تناولها بخلايا الثدييات وإدراجها في الحمض النووي الريبي المركبة حديثا، مما يتيح وضع العلامات نبض من الجيش النيبالي الملكي في إطار زمني محدد. BrU أقل سمية من الاتحاد الأوروبي 5 و 4-تو، مما يجعلها التماثلية المفضل لاختيار11،12.
يمكن استخدام BrU للملكية الفكرية للتحقيق بمعدل توليف الحمض النووي الريبي والاستقرار، ومما يميز بين الأسباب الكامنة وراء التغييرات في مجموع الجيش الملكي النيبالي. هذه المادة سوف تركز على قياس توليف الحمض النووي الريبي، ويشير إلى مرجع2 لمزيد من التفاصيل عن التحقيق بشأن استقرار الجيش الملكي النيبالي. للتحقيق في توليف الحمض النووي الريبي، وصفت الخلايا هي بإيجاز مع BrU مثلاً ح 1 تليها BrU-IP1 (الشكل 1). هذا يتيح للقياسات من الحمض النووي الريبي توليفها في غضون الفترة القصيرة وضع العلامات والتغيرات الملاحظة سيعطي تقدير أفضل للوائح في توليف الحمض النووي الريبي من بقياس التغيرات في مجموع الجيش الملكي النيبالي ب RT-قبكر. ومع ذلك، فإنه تجدر الإشارة إلى أنه على الرغم من أن وقت الوسم، على سبيل المثال، فقط ح 1، تدهور يمكن لا يزال لها تأثير على مستويات الحمض النووي الريبي ولاحظ.
الجيش الملكي النيبالي من تجارب برو–الملكية الفكرية مناسبة لتحليل المصب RT qPCR1 أو2،تسلسل الجيل القادم13. القياسية الحمض النووي الريبي الكشف عن الأساليب الأخرى، مثل شمال النشاف أو ribonuclease حماية المقايسة، قد تنطبق على بعض الكشف أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول استخدام برو–الملكية الفكرية لتحديد إنتاج الحمض النووي الريبي بوسم حديثا إنتاج الحمض النووي الريبي ح 1 مع برو، تليها مباشرة استخراج الحمض النووي الريبي وإيمونوبريسيبيتيشن من الجيش النيبالي الملكي المسمى BrU. هذا الأسلوب قد وصفت سابقا في مرجع16، وتتضمن هذه ال…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مؤسسة Lundbeck، جامعة آرهوس، وداندريتي، والشركة Lundbeck تؤيد هذا العمل.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
- Kofoed, R. H., et al. Polo-like kinase 2 modulates α-synuclein protein levels by regulating its mRNA production. Neurobiol. Dis. 106, 49-62 (2017).
- Imamachi, N., et al. BRIC-seq: A genome-wide approach for determining RNA stability in mammalian cells. Methods. 67, 55-63 (2014).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J. Mol. Biol. 3, 318-356 (1961).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 152, 1237-1251 (2014).
- Farrer, M., et al. Comparison of kindreds with parkinsonism and α-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 55, 174-179 (2004).
- Khodr, C. E., Becerra, A., Han, Y., Bohn, M. C. Targeting alpha-synuclein with a microRNA-embedded silencing vector in the rat substantia nigra: Positive and negative effects. Brain Res. , 47-60 (2014).
- Cooper, J. M., et al. Systemic exosomal siRNA delivery reduced alpha-synuclein aggregates in brains of transgenic mice. Mov. Disord. 29, 1476-1485 (2014).
- Magdalan, J., et al. alpha-Amanitin induced apoptosis in primary cultured dog hepatocytes. Folia Histochem. Cytobiol. 48, 58-62 (2010).
- Lu, D. F., et al. Actinomycin D inhibits cell proliferations and promotes apoptosis in osteosarcoma cells. Int. J. Clin. Exp. Med. 8, 1904-1911 (2015).
- Bensaude, O. Inhibiting eukaryotic transcription. Which compound to choose? How to evaluate its activity?. Transcription. 2, 103-108 (2011).
- Tani, H., et al. . Nuclear Bodies and Noncoding RNAs. Methods in Molecular Biology. 1262, 305-320 (2015).
- Meneni, S., et al. 5-Alkynyl-2′-deoxyuridines: chromatography-free synthesis and cytotoxicity evaluation against human breast cancer cells. Bioorg. Med. Chem. 15, 3082-3088 (2007).
- Meola, N., et al. Identification of a Nuclear Exosome Decay Pathway for Processed Transcripts. Mol. Cell. 64, 520-533 (2016).
- Zhao, B. S., Roundtree, I. A., He, C. Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18, 31-42 (2016).
- Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J. Appl. Microbiol. 113, 1014-1026 (2012).
- Paulsen, M. T., et al. Use of Bru-Seq and BruChase-Seq for genome-wide assessment of the synthesis and stability of RNA. Methods. 67, 45-54 (2014).
- Dölken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. Rna. , 1959-1972 (2008).
- Raghavan, A., et al. Genome-wide analysis of mRNA decay in resting and activated primary human T lymphocytes. Nucleic Acids Res. 30, 5529-5538 (2002).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Res. 16, 45-58 (2009).
- Pandya-Jones, A., et al. Splicing kinetics and transcript release from the chromatin compartment limit the rate of Lipid A-induced gene expression. RNA. 19, 811-827 (2013).
