Investigación de la síntesis de RNA utilizando 5-Bromouridine etiquetado e inmunoprecipitación
Summary
Este método puede utilizarse para medir la síntesis de ARN. 5-Bromouridine se añade a las células e incorporado en el RNA sintetizado. Síntesis de ARN se miden por la extracción de RNA inmediatamente después del etiquetado, seguido de la inmunoprecipitación de 5 Bromouridine-orientada con RNA y análisis por transcripción reversa y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa.
Abstract
Cuando se comparan los niveles de estado estacionario RNA entre dos condiciones, no es posible distinguir si los cambios son causados por alteraciones en la producción o degradación de RNA. Este protocolo describe un método para la medición de la producción de RNA, utilizando 5-Bromouridine etiquetado de RNA seguido por la inmunoprecipitación, que permite la investigación de ARN sintetizado en un corto plazo (p. ej., 1 h). La ventaja de 5-Bromouridine-etiquetado e inmunoprecipitación sobre el uso de tóxicos inhibidores transcripcionales, como α-amanitin y actinomicina D, es que hay no o muy poco efectos sobre la viabilidad celular durante el uso a corto plazo. Sin embargo, porque 5-Bromouridine-inmunoprecipitación solo captura RNA producido en el corto plazo etiquetado, producido lentamente como degrada rápidamente RNA puede ser difícil de medir por este método. El RNA marcado con el 5-Bromouridine capturado por la 5-Bromouridine-inmunoprecipitación puede analizarse por transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa y secuencia de la generación siguiente. Todos los tipos de ARN pueden ser investigados, y el método no se limita a medir mRNA como se presenta en este ejemplo.
Introduction
5-Bromouridine (BrU) inmunoprecipitación (IP) permite el estudio de la producción de RNA en células con n o efectos muy limitados sobre la fisiología de la célula durante el breve período1,2de etiquetado. El método se basa en la incorporación del derivado sintético de la uridina BrU en el RNA recién sintetizado seguido por IP de ARN marcada con anticuerpos anti-BrU (figura 1).
Se ha sabido por décadas que la síntesis de proteínas puede ser regulada transcripcionalmente, y la existencia de factores de transcripción fue presumida hace más de 50 años3. Hoy en día, se sabe que varias enfermedades son causadas por la desregulación de la estabilidad del RNA y transcripción (suplementario S1 figura en la referencia4), y la capacidad para medir los cambios en la producción de RNA es de gran importancia en la enfermedad de comprensión desarrollo.
Por otro lado, las herramientas para regular la producción de RNA proporcionan nuevas posibilidades para el tratamiento de enfermedades causadas por la expresión de proteína demasiado o muy poco, o acumulación de la proteína tales como la enfermedad de Parkinson (EP). La proteína predominante de acumulación de agregados insolubles como en la EP es la α-sinucleína, y el nivel de α-sinucleína está directamente relacionado con la enfermedad, como la multiplicación del gen del gen α-sinucleína causa familiar PD5. Por otra parte, α-sinucleína agregados de manera dependiente de la concentración. Regulación a la baja de niveles de mRNA de α-sinucleína, resulta una estrategia terapéutica interesante, que se ha logrado con éxito utilizando ARN de interferencia para disminuir la pérdida de células neuronales en modelos de roedores de PD6,7.
Es importante poder medir los cambios en la producción de RNA causado por enfermedad o intervenciones terapéuticas. Estado de la técnica métodos para medir niveles de estado estacionario del ARN, como transcripción reversa seguida de reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa (RT-qPCR), no son capaces de distinguir entre los cambios causados por la regulación transcripcional o alterado Estabilidad del RNA. Un método ampliamente utilizado para la investigación de las tasas de decaimiento de RNA está bloqueando de la maquinaria transcripcional con compuestos tales como α-amanitin o actinomicina D seguido de medidas de los RNAs que se decae. Sin embargo, hay algunos problemas asociados con una obstrucción total de la transcripción en células, como la inducción de apoptosis8,9. Al lado de los efectos citotóxicos, transcripcionales inhibidores también presentan varios problemas técnicos, como la lenta absorción celular de α-amanitin y falta de especificidad de la actinomicina D (revisado en la referencia10).
Para evitar la obstrucción total de la transcripción, se han utilizado análogos de nucleótido, como 5-ethynyl uridina (UE 5), 4-thiouridine (4-TU) y BrU. Estos son fácilmente tomados por las células mamíferas e incorporados en el RNA recién sintetizado, que pulso-etiquetado de ARN dentro de un marco de tiempo específico. BrU es menos tóxico que la UE-5 y 4-TU, lo que es el análogo recomendado: opción11,12.
BrU-IP puede utilizarse para investigar tanto la tasa de síntesis de ARN y la estabilidad y así distinguir entre las causas de los cambios en el ARN total. Este artículo se centrará en la medición de la síntesis de ARN y se refiere a la referencia2 para más detalles sobre la investigación de la estabilidad del RNA. Para investigar la síntesis de ARN, las células se etiquetan brevemente con BrU por ejemplo para 1 h seguida de BrU-IP1 (figura 1). Esto permite mediciones de ARN sintetizado en el corto plazo etiquetado y cambios observados le dará una mejor estimación de las regulaciones en la síntesis de RNA que midiendo cambios en el ARN total por RT-qPCR. Sin embargo, debe mencionarse que a pesar de que el tiempo de etiquetado es, por ejemplo, sólo 1 h, degradación todavía puede tener una influencia en los niveles de RNA observados.
ARN de experimentos de BrU-IP son adecuados para análisis posterior por RT-qPCR1 o la siguiente generación de la secuencia2,13. Otros métodos de detección de RNA estándar, tales como el borrar norteño o ensayo de protección de ribonucleasa, también pueden ser aplicables para ciertos RNAs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el uso de BrU-IP para determinación de la producción de RNA por etiquetado de nuevo produce RNA para 1 h con BrU, seguido por la inmediata extracción de RNA e inmunoprecipitación de ARN marcado con BrU. Este método ha sido descrito previamente en la referencia16, y este artículo incluye algunos pasos adicionales para aumentar la especificidad IP y pureza del RNA, por granos pre-tratamiento con concentraciones bajas de BrU, así como un paso de purificación de fenol-c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fundación Lundbeck, Universidad de Aarhus, Dandrite y Lundbeck A/S apoyaron este trabajo.
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
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