用 5-Bromouridine 标记和免疫沉淀 RNA 合成的研究
Summary
该方法可用于测量 RNA 的合成。5-Bromouridine 被添加到细胞中, 并纳入合成 RNA。rna 的合成是通过标记后立即提取 rna 来测量的, 其次是标记 rna 的 5 Bromouridine 靶向免疫沉淀, 并通过反向转录和定量聚合酶链反应进行分析。
Abstract
当在两种情况下比较稳态 RNA 水平时, 不可能区分变化是由生产的改变还是 RNA 的退化引起的。该协议描述了一种测量 rna 生产的方法, 使用了 rna 的 5 Bromouridine 标签, 然后是免疫沉淀, 它能够在短时间内对合成的 rna 进行调查 (例如, 1 小时).5-Bromouridine 标签和免疫沉淀在使用有毒转录抑制剂, 如α amanitin 和放线菌 D 的优点是, 在短期使用中, 对细胞的生存能力没有或非常低的影响。然而, 由于 5-Bromouridine-免疫沉淀只捕获在短标签时间内产生的 rna, 缓慢产生, 以及迅速退化的 rna 可能难以测量的方法。由 5-Bromouridine-免疫沉淀捕获的 5-Bromouridine 标记 RNA 可以通过反向转录、定量聚合酶链反应和下一代测序来分析。可以对所有类型的 RNA 进行研究, 该方法不限于本例中所示的测量 mRNA。
Introduction
5-Bromouridine (老兄) 免疫沉淀 (IP) 允许在简短的标签期间, 对细胞生理学没有或非常有限影响的细胞中 RNA 的产生进行研究 1, 2.该方法的基础是将合成苷衍生物老兄纳入新合成的 rna, 然后使用抗老兄抗体的标记 RNA 的 IP (图 1)。
几十年来, 人们已经知道蛋白质合成可以被转录调控, 转录因子的存在在50年前被推测为3。今天, 已知一些疾病是由转录和 rna 稳定性的失调引起的 (补充图 S1 在参考4), 并且测量 RNA 生产的变化的能力在了解疾病是非常重要的发展。
另一方面, 调控 RNA 生产的工具为治疗因过少或过多的蛋白质表达或诸如帕金森氏病 (PD) 等蛋白质积累而引起的疾病提供了新的可能性。由于α-synuclein 基因的增殖导致家族 pd5, synuclein 中的主要蛋白质积累为不溶性聚集体, α-synuclein 的水平与该病直接相关。此外, α synuclein 聚集在浓度依赖性的方式。下调的α synuclein mRNA 水平是一个有趣的治疗策略, 已经成功地获得了利用 RNA 干扰, 以减少神经元细胞损失的 PD 啮齿动物模型6,7。
重要的是要能够测量 RNA 生产的变化引起的任何疾病或治疗干预。测量 RNA 稳态水平的艺术方法, 如反向转录和定量聚合酶链反应 (RT-qPCR), 不能区分转录调节引起的变化或改变RNA 的稳定性。一种广泛应用的 RNA 衰变率调查方法是使用诸如α amanitin 或放线菌 D 等化合物的转录机械阻断, 然后再测量衰变 rna。然而, 在细胞中转录的整体堵塞, 如诱导凋亡8,9, 也存在一些问题。除细胞毒作用之外, 转录抑制剂还存在几个技术问题, 例如 amanitin 细胞的缓慢摄取和放线菌 D 缺乏特异性 (参考文献10)。
为了避免转录的整体堵塞, 核苷酸类似物已经被使用, 如 5-乙炔苷 (5-欧盟), 4-thiouridine (4) 和老兄。这些都很容易被哺乳动物细胞吸收并纳入新合成的 rna 中, 从而在特定的时间范围内对 rna 进行脉冲标记。老兄的毒性低于 5-欧盟和 4, 使其成为首选的模拟选择11,12。
老兄可以用来研究 rna 合成的速率和稳定性, 从而区分总 rna 变化的根本原因。本文将重点研究 rna 合成的测量, 并参考2 , 以了解 rna 稳定性的研究情况。为了研究 RNA 的合成, 细胞用老兄例如1 小时的简单标记, 后跟老兄-IP1 (图 1C)。这使得在短标签时间内合成的 rna 的测量和观察到的变化将比通过 qPCR 测量总 rna 的变化来更好地估计 rna 合成中的规则。然而, 应该提到的是, 即使标签时间, 例如, 只有1小时, 退化仍然可能对观察到的 RNA 水平产生影响。
老兄-IP 实验的 RNA 适用于 RT qPCR1或下一代测序2,13的下游分析。其他标准 rna 检测方法, 如北印迹或核糖核酸保护试验, 也可能适用于某些 rna。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了使用老兄-IP 来确定 rna 生产通过标签新产生的 rna 1 小时与老兄, 然后立即 RNA 提取和免疫沉淀老兄标记 rna。此方法以前在引用16中进行了描述, 本文还包括一些附加步骤以提高 IP 特异性和 RNA 纯度, 方法是先处理低浓度老兄的珠子以及苯酚-氯仿净化步骤, 以增加 RNA 纯度跟随 IP。此外, 我们还通过比较老兄和非老兄治疗细胞中捕获的 RNA, 来展示老兄的特异性。苯酚-氯?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lundbeck 基金会、奥胡斯大学、Dandrite 和 Lundbeck 支持这项工作。
Materials
| Ribolock Rnase inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| Dynabeads M-280 Sheep anti-mouse IgG | Life Technologies | 11202D | |
| α-Bromodeoxyuridine mouse antibody | BD Bioscience | 555627 | |
| Nanodrop 1000 | Thermo Fisher | Ultraviolet-visible spectrophotometry | |
| Water-Saturated Phenol pH 6.6 | ThermoFisher | AM9712 | |
| Phenol:Chloroform:IAA 25:24:1 pH 6.6 | ThermoFisher | AM9732 | |
| High Pure RNA isolation Kit | Roche | 11828665001 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher | 4368814 | |
| Taqman Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444557 | qPCR Master Mix |
| Taqman RNA probes | ThermoFisher | SNCA: Hs01103383_m1, 18sRNA: Hs03928985_g1, ACTB: Hs01060665_g1, HMBS: Hs00609296, NADH: Hs01072843_m1 | Flurogenic probes |
| 7500 Fast Real-Time PCR system | Applied Biosystems | ||
| HEK293T cell line | ATCC | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Lonza | BE12-604F | |
| Fetal calf serum | Biochrom | S0115 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom | A2213 | |
| Hank's buffer | 5,3 mM KCl, 0.44 mM KH2PO4, 0.2 mM Na2HPO4 and 136.8 mM NaCl pH 6.77, autoclaved. | ||
| DEPC-H2O | 0.1% diethylpyrocarbonate treated H2O | ||
| 2xBrU-IP Buffer | 40 mM Tris-HCl pH 7.5 and 500 mM NaCl in DEPC H2O | ||
| 2xBrU-IP+BSA/RNAse inhibitor | 2xBrU-IP buffer supplemented with 1 μg/μL BSA and 80 U/mL Ribolock | ||
| BrU-IP+ 1 mg/mL heparin | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 DEPC-H2O and supplemented with 1mg/mL heparin | ||
| 1xBrU-IP | 2xBrU-IP buffer diluted 1:1 in DEPC-H2O and supplemented with 0.5 μg/μL BSA and 20 U/mL Ribolock | ||
| Elution buffer | 0.1% SDS in RNAse-free H2O | ||
References
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