Summary

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Published: March 19, 2018
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Abstract

Tecidos animais e vegetais é composto de populações distintas de células. Estas células interagem ao longo do tempo para construir e manter o tecido e podem causar doenças quando interrompido. Os cientistas desenvolveram técnicas inteligentes para investigar características e dinâmica natural dessas células no tecido intacto por expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos de células. No entanto, às vezes, experiências exigem mais selecionada visualização de células dentro do tecido, às vezes a forma unicelular ou população de células. Para alcançar este objectivo e Visualizar células únicas dentro de uma população de células, os cientistas têm utilizado a célula única photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demonstrar essa técnica, mostramos aqui como direcionar a luz UV para uma célula Eos-expressando um interesse de uma intacta, vivendo zebrafish. Nós então imagem essas células de Eos+ photoconverted 24h depois para determinar como eles mudaram no tecido. Descrevemos duas técnicas: única célula photoconversion e photoconversions das populações de células. Estas técnicas podem ser usadas para visualizar interações célula-célula, célula-destino e diferenciação e migrações de célula, tornando-se uma técnica que é aplicável em numerosas questões biológicas.

Introduction

Várias células distintas interagem para construir e manter o complexos tecidos animais e vegetais. Estas células são frequentemente intercalados e difícil de distinguir de vizinhos em um nível de célula única sem microscopia de alta resolução que exigem a fixação do tecido. No entanto, para compreender a forma como estes tecidos, são mantidas e tornar-se doente, tem sido essencial para investigar como single as células dentro do tecido estão interagindo ao longo do tempo. Idealmente, estas experiências exigem a rotulagem de células únicas dentro de um tecido de forma não-invasiva, sem a exigência de fixação. Os cientistas agora desenvolveram inúmeras técnicas para realizar esta tarefa1,2,3,4.

A descoberta e a implementação da proteína medusas verde fluorescente (GFP) foi uma abordagem interessante que permitiu para a rotulagem de células distintas em um ambiente de tecido1. Usando promotores de célula específica, é possível geneticamente, selecionar um subconjunto de células que são rotulados1. Alternativamente, viral induzida expressão de GFP pode ser utilizada para usuário-selecionado expressão de GFP3,4. Embora bastante útil, expressão mediada genética de GFP não permite expressão selecionado pelo usuário dentro de um subconjunto de células no tecido; e a expressão viral de GFP, apesar de vantajoso, pode ser invasiva. Com o advento de técnicas inteligentes como Brainbow expressar proteínas fluorescentes distintas mais escassa dentro de tecidos e derivados GFP, tornou-se possível visualizar células únicas e as interações entre eles em tecido complexo2, 5. no entanto, essas abordagens rotular as células de uma forma aleatória. Se o experimento desejado requer a visualização de uma única célula ou a população de células é definido pelo experimentador, são, portanto, limitados. Com tais experiências, seria vantajoso ter uma proteína fluorescente geneticamente expressa que pode ser manipulada para distinguir, de forma única célula, que de outras células não-fluorescente fluorescentes.

Para atingir esse objetivo e visualizar a biologia celular de células únicas dentro de um tecido vivo complexo, a comunidade científica usa única célula photoconversion de proteínas fluorescentes distintas6,7,8. Usando geneticamente controlado a expressão de uma proteína de photoconvertible (i.e., eos, kaede, etc.) que transita de um verde para vermelho estado fluorescente quando exposto aos raios UV (488 nm) a luz, podemos distinguir uma única célula de sua fluorescente etiquetadas vizinhos de7,6,8. Esta abordagem utiliza um aparelho ligado ao nosso microscópio confocal que pode direcionar a luz de uma pilha de laser para uma região de difração limitada de interesse. Com esta técnica, podemos rotular ou células únicas ou maiores populações em uma maneira definida pelo usuário9,10,11. A técnica é minimamente invasiva em comparação com injeções de célula única de GFP viral. Como uma prova de conceito, mostramos que podemos photoconvert células únicas dentro de um gânglio no sistema nervoso periférico e as maiores populações de photoconvert como células localizadas no lado ventral da medula espinhal9,10, 11,12. Podemos então Visualizar estas photoconverted populações de células 24h mais tarde para ganhar a introspecção em seu movimento e diferenciação durante o desenvolvimento.

Protocol

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Notre Dame institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização. 1. preparação da amostra de Zebrafish Coloque um macho adulto e um adulto feminino Tg (proteína conversível) para a câmara de acasalamento por procedimentos-padrão13. Neste manuscrito, use Tg(sox10:eos) peixe9 por causa do acesso, mas outras linhas transgénicas com proteína de photoconvertible pod…

Representative Results

Photoconversion de proteínas fluorescentes pode ser usado para rotular células distintas dentro de um tecido de6. Para demonstrar isso, Tg(sox10:eos) peixe9 foram usados para expressar a proteína photoconvertible Eos sob as sequências reguladoras de sox10. Os animais Tg(sox10:eos) em 48 hpf foram montados primeiro e então fotografada para detectar qualquer photoconversion não-específicos que possam ter ocorr…

Discussion

Em tecidos complexos, distintos tipos de células organizam em domínios específicos. Recentemente, as técnicas têm sido utilizadas para células individuais de etiqueta dentro destes tecidos grandes estruturas1,2,3. Aqui vamos demonstrar duas técnicas que podem ser utilizadas da mesma forma para visualizar tanto interações célula única e interações de população celular dentro de tecidos complexos. A vantagem da téc…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Bernard Kulemaka e membros do laboratório de Smith para seus comentários úteis e orientação de reagente, Sam Connell e Brent Redford de 3i para responder perguntas de imagem e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart para cuidados de zebrafish. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Notre Dame, a Elizabeth e Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigação de Zebrafish na Universidade de Notre e centro de células-tronco e medicina regenerativa da Universidade de Notre Dame. Todos os estudos animais foram feitos em conformidade com a Universidade de Notre Dame IACUC ao Dr. Cody Smith.

Materials

Tg(sox10:eos) zebrafish animals Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dish VWR 25384-302
Embryo medium Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarose dot scientific inc 9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish Ted Pella Inc. 14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine) Fluka analytical A5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters Zeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets 3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion 405 nm laser
Slidebook software 3i
Methylene blue Kordon

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

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Citer Cet Article
Green, L., Smith, C. J. Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish. J. Vis. Exp. (133), e57024, doi:10.3791/57024 (2018).

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