태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

1. 북 아 일 Vitripennis 식민지 양육 여러 식민지를 설정 (~ 3-5) 버그 기숙사 장에 200-500 북 아 일 vitripennis 성인 (여자: 남자의 3:1 비율)을 배치 하 여.참고: 버그 기숙사, 말 벌을 사용 하도 여러 개의 작은 유리 시험관 약 15-20 말 벌/유리병으로 목화와 함께 연결에서 전파 수 있습니다. 25 ± 1 ℃ 30% 상대 습도, 12시 12분 빛 어두운 주기에, 1:10 (v/v)의 작은 물방울으로 매일 그들을 먹이에 말 벌을 유지 자당/물 솔루션.주: 말 벌 식민지 및 전파 제어 습도; 없이 실내 온도에 지휘 될 수 있다 또한 그러나, 온도 25 ° C는 배아의 발달 타이밍을 낮출 것 이다 약간 보다 낮은. 말 벌 주사 전에 적어도 4 일 동안 친구를 허용 합니다. 처음 2 일 동안 신선한 먹이를 성관계 여성 수 1:10 (v/v)의 작은 방울으로 서 S. bullata pupae, 자당/물 솔루션. 다음 2 일에 대 한 산란 사이트, 그들을 아주 벗 만들기의 여성 말 벌을 박탈 하 blowfly 번데기를 제거 합니다. 2. 수집 및 북 아 일 Vitripennis 전 blastoderm 단계 배아의 맞춤 Parasitize에 여성 말 벌 허용 (배아 oviposit) 젊은 주인 (S. bullata pupae)으로. 유지 하기 위해 호스트 신선한, 즉시 그들을 취득 후 4 ° C에서 호스트를 저장 하 고 필요할 때만 제거.참고: 젊은 호스트 이전 호스트 어두운 컬러 puparium (그림 1A) 반면 빨간 색된 puparium를 함으로써 확인할 수 있습니다. 개별 신선한 S. bullata 장소 번데기 크기의 구멍을 가진 거품 스 토퍼에 pupae 중심으로 잘라. 노출만 ~ parasitization와 쉽게 태아 컬렉션의 최대 농도 대 한 호스트의 앞쪽 끝 (선호 산란 사이트)의 0.2 cm.참고: 앞쪽 끝은 반올림, 후부 끝은 두꺼운 ‘ 분화구 같은 ‘ 오프닝 (그림 1B)를 포함 하는 동안. 으로이 배열에서 호스트 번데기 (100 벌 당 대략 5 호스트 pupae)을 놓고 말 벌 그들 (그림 2- ii) parasitize을 허용 하도록 대략 45 분을 기다려야 합니다.참고: 그것은 매우 중요 하다는 배아, 어린 이상적으로, 사전 blastoderm 단계에 다는 것을 보장 하기 위해 oviposited의 첫 번째 시간. 오래 된 배아 (> 1.5 h) 주입 수 없습니다. 손으로 고 부드럽게 칫 솔 질/외면 어떤 거주 말 벌 들을 검색 하 여 개미의 호스트를 제거 합니다. 후 신선한 호스트와 함께 그들을 대체 모든 ~ 15 분 일찍 주사 하는 동안 계란을 개최 수집 계속. 케이지에서 손으로 갓 parasitized 호스트를 제거 합니다. 현미경으로 해, 겸 자를 사용 하 여 신중 하 게 멀리 명. vitripennis 계란 (그림 2- 3 세) 노출 외부 puparium (번데기 껍질)의 후부 끝 (0.4 cm) 껍질.참고: 합니다 주의 번데기 피부; puncturing 방지 이 경우는 hemolymph microinjection에 대 한 제거 하기 매우 어려울 것입니다 말 벌 배아 축 축 하 게 됩니다. 액체 접착제를 사용 하 여 태아 맞춤 슬라이드 (그림 3)를 준비 하는 깨끗 한 유리 슬라이드에 coverslip 접착제.그러나 참고: 높은 성능 인스턴트 접착제 본드 강도 높이기 위해 사용 되 고 건조 속도,에서 슬라이드에 주위를 움직이고는 coverslip 유지할 수 있는 어떤 접착제는 허용. 箱 호스트 로부터 신중 하 게 젖은 미세 팁 붓 호스트의 부드러운 번데기 피부를 손상 하지 않도록 만드는 배아.참고: ‘ 배아를 선택,’는 본질적으로 ultrafine 집게의 쌍의 절반을 붓 대신 사용할 수 있습니다. 전송 ~ 20 배아 하나 하나에 슬라이드, 젖은 붓으로 coverslip의 측면에 인접 한. 태아의 뒤 끝은 같은 방향으로 (그림 2- 4) 지적을 커버 슬라이드의 가장자리에 대 한 배아의 앞쪽 끝을 방향을 정하십시오. 이것은 모든 배아 중 동일한 위치에 주입의 높은 정밀도 대 한 허용.참고:이 향상 된 기술은 배아21,22위에서 설명한 대로 슬라이드를 해결 하기 위해 이중 면 끈끈한 테이프를 필요 하지 않습니다. 또한, 태아만 하거나 마십시오 주입 명. vitripennis 태아 microinjection22위에서 설명한 대로 동안 halocarbon 기름으로 계란을 커버. 3. 바늘 준비 Microinjections 장소에 바늘 끌어당기는 aluminosilicate 모 세관 유리.참고: 좋은 바늘은 성공적인 명. vitripennis 에 대 한 중요 한 태아 주사. 주사 바늘은 샤 프와는 chorion 통해 쉽게 침투 수 있도록 미세 팁 있어야 합니다. 석 영 및 붕 규 산 모 세관 바늘은 또한 일 수 있다 (그림 4)를 사용. 605 하 열 , 속도 130, 80 지연 , 당겨 70, 및 500 압력 바늘 끌어당기는 사람에 설정 합니다.참고: 추가 바늘 끌어당기는 설정 석 영 및 붕 바늘을 당기는 표 1;에서 볼 수 있습니다. 매개 변수는 다른 pullers 및 필 라 멘 트에 대 한 달라질 수 있습니다. 활성화를 만드는 올바른 바늘 바늘 끌어당기는 사람. 여러 개의 바늘의 생산을 위해 필요에 따라 반복 합니다.참고: 가져온된 바늘 여러 병렬 상업 모델러 클레이의 롤을 포함 하는 배양 접시에 그들을 배치 하 여 저장할 수 있습니다. 다이아몬드 연마 플레이트 약 10에 팁으로 약간 바늘 팁을 경사 25 ° c (그림 2- 3 세) s.참고: 주사 바늘 동시에 바늘을 통해 regents의 흐름을 강화 하면서 최소한의 피해와 배아로 항목을 홍보 하 여 빗면에서 혜택. 4. 태아 Microinjection 게놈 수정 시 약 (예: transposon + 도우미 transposase, 또는 CRIPSR 시 약 등),구성 된 주입 혼합물을 준비 하 고 얼음에 그것을 유지. Microloader 팁을 사용 하 여 주입 바늘 주입 혼합물의 2 µ L와 함께 로드 합니다.참고: 프로토콜에서 주입 혼합 단일 가이드 RNA (sgRNA) (s) 및 H2o.에서에서 혼합 재조합 Cas9 단백질의 구성 복합 현미경의 무대에 줄지어 배아와 유리 슬라이드를 놓습니다. 조심 스럽게 25-35 °의 각도 수직으로 태아의 뒤 끝에 바늘을 삽입 합니다.주사 주입 혼합물 (배아의 볼륨의 약 2-10%)의 1-5 pL 고 태아 혼합물 (그림 2- 4) 주입으로 약간 팽창에 나타나는지 확인 합니다.참고: 너무 많은 주입 혼합 배아에 주입 하는 경우 그것은 수 있습니다 버스트 배아에서 세포질을 밝혀. 또한, 잘못 경사지 또는 바늘의 너무 큰 깨진 여 배아 파열을 일으킬 수 있습니다. 막힘 발생 하는 경우 다시 경사지 바늘을 보십시오. 명. vitripennis 배아의 세포질은 비정상적으로 점성 및 스티커, 자주 바늘 (1/25 주사) 막힘에 이르게.참고: 그것은 드 이온된 수는 붓을 사용 하 여 정기적으로 추가 하 여 주입 기간 동안 태아를 축축한 유지 하는 것이 중요입니다. 브러시에 물 양은 배아를 이동 및 쉽게 정렬 키입니다. 너무 많은 물을 부동 및 너무 작은 물 그들 어려운 주위에 이동 하 게 하는 배아 발생 합니다. 주사 ~ (약 10 분 소요 한다) 한 번에 20-40 알 다음 중지. 주입 된 달걀을 가볍게 만져 젖은 붓으로 주입 된 달걀을 전송 하 고 호스트에 그들을 배치. 달걀의 배치를 계획 사용 하 여 다시 신선한 새로 주입 계속 (> 1 시간 이전).참고: 이상적으로이 프로토콜은 가장 효과적인, 한 사람이 지속적으로 수집 하 고 달걀을 줄 경우 다른 사람 주입 게놈 수정 구성 요소 이며 호스트 pupae에 주입 된 배아를 이식 하는 동안. 5. Injected G0 명. vitripennis Pre-stung 호스트에 배아 이식 이전 쏘 이다 S. bullata 에 주입 된 G0 배아를 신중 하 게 배치 microinjection 후 젖은 붓으로 번데기 (그림 2- 6).참고: microinjection에 대 한 배아를 수집 하는 데 사용 하는 호스트 pupae이이 목적을 위해 작동 합니다. 또한, 상당한 노력에도 불구 하 고 현재는 사용된22수 있는 사용할 수 있는 인공 다이어트입니다. 인구 과잉과 애벌레 경쟁을 피하기 위해 단일 미리 쏘 호스트에 한 번에 40까지 주입 된 배아 하나를 놓습니다.참고: 주입은에 손상을 태아; 호스트 pupae에 주입 된 배아의 부주의 이식 주입 된 컴포넌트나, 노른자위를 짜 내 고 배아의 죽음으로 이어질 수 있습니다. 호스트 pupae 젖은 필터 종이와 면봉, 페 트리 접시에 놓고 주입된 태아 (대략 1-2 일)이 부 화까지 약 70%의 습도와 25 ° C에서 그들을 품 어 (그림 2- 7 세).참고: 중요 한 것은, 호스트 남아 있을 수 있습니다는 벗 겨와 함께 puparium 고 명 vitripennis 계란 개발할 것입니다 일반적으로 너무 오랫동안 그들은 건조를 방지 하기 위해 습도 챔버 (젖은 필터 종이와 면봉 배양 접시)에서 알을 품는. 습도 제어할 수 없는 경우에 약화 면봉에서 습도 실 온에서 배양 하는 것은 충분 합니다. G0 배아 해치 후 70%의 습도 25°C에서 새로운 배양 접시에 호스트 pupae를 전송. 호스트 pupae와 주입된 G0 애벌레를 매일 모니터링 합니다. 만약 호스트 pupae 파울 냄새, 새로운 건강 pupae를 주입된 애벌레를 전송. 6. 게놈 수정에 대 한 심사 좋은 붓 또는 배아 선택을 사용 하 여 호스트에서 각 명. vitripennis pupae를 제거 합니다. 주입 된 G0 애벌레 약 8 일 포스트 주입을 pupate 한다. 목화와 함께 연결 된 격리 된 유리 유리병으로 각 제거 번데기를 배치 하 고 G0 성인, 빗금된 여성 된다는 것 처녀 다운스트림 유전 십자가 함께 도움이 될 것입니다 보장으로 등장 하도록 허용.참고: 여성 정렬할 수 있습니다 남성에서 날개 길이: 암컷 몸 프로필 옆에 설정 과거를 확장 하는 긴 날개를가지고. 모든 microinjected 여성 pupae 연결된 유리병에 함께 놓일 수 있다 그리고 같은 남성 pupae에 적용 됩니다. 일수로, 어느 PCR 또는 시각적으로 후 화면 G0 개인 (phenotypic 유전자를 방해) 하는 경우. 예를 들어 CRISPR는 삭제 특정된 유전자에 방해 유전자 표시 형 수 여 하는 경우 다음 정렬 하 고 영향을 받는 형 (그림 2- 8 세)의 돌연변이 체 버전 개인 유지21. 그러나, 영향을 받는 유전자는 필수적인 유전자의 돌연변이 등 보이지 않는 표현 형에 대 한 인코딩 하는 경우 복구에 대 한 화면을 횡단 체계 (크로스 G0 와 야생 타입 여성, 남성 또는 교차 G0 에서 야생 유형으로 여성) 수행 시 금 치 또는 무 균을 통해 상속 돌연변이입니다.참고: D. melanogaster, N. vitripennis 성인과 유사한 CO2 간단 조작에 대 한 허용에 노출에 의해 움직일 수 있다. 또한, unmated 여성 줄 것 이다 상승 100% 단일 남성 broods, 따라서 돌연변이 unmated 여성 후속 분석을 위해 사용 될 수 있는 돌연변이 남성의 많은 수를 야기할 수 있는.노트: 필수 유전자에 돌연변이 살아남은 G0 주입 여성 (아마도 heterozygous 돌연변이 대 한) 야생 타입 남성;에 짝짓기에 의해 유지 되어야 할 것 이다 G1 여성 자손의의 치명적인 것이 특정 한 경우 G1 남성 자손의 절반 치명적인 돌연변이의 상속으로 인해 죽을 한다. Outcross G0 성인과 화면 G1 자손 transgene 삽입 경우 목표는 transgenesis transgenesis 마커를 사용 하 여에 대 한. 현재 transgenesis 명. vitripennis에 설명 될 남아 있습니다.