Summary

Zubereitung frische retinalen Scheiben von Erwachsenen Zebrafisch für Ex Vivo Imaging-Experimente

Published: May 09, 2018
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Summary

Imaging netzhautgewebe kann einzellige Informationen liefern, die von den traditionellen biochemischen Methoden gesammelt werden kann nicht. Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Netzhaut Scheiben von Zebrafisch für die konfokale Bildgebung. Fluoreszierende genetisch codierten Sensoren oder indikatorfarbstoffen erlaubt Visualisierung von zahlreichen biologischen Prozessen in verschiedenen retinalen Zelltypen.

Abstract

Die Netzhaut ist ein komplexes Gewebe, die initiiert und die ersten Schritte der Vision integriert. Funktionsstörung des retinalen Zellen ist ein Markenzeichen von vielen blendenden Krankheiten, und zukünftige Therapien abhängen, wie verschiedene Retinal grundlegende Verständnis, dass Zellen normal zu funktionieren. Gewinnung solcher Informationen mit biochemischen Methoden hat schwierig erwiesen, da Beiträge von bestimmten Zelltypen in der Netzhaut Zellmilieu vermindert werden. Live retinale Bildgebung bieten einen Überblick über zahlreiche biologische Prozesse auf subzellulärer Ebene, dank einer wachsenden Zahl von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren. Jedoch wurde diese Technik bisher beschränkt, Kaulquappen und zebrafischlarven, die äußersten Netzhaut Schichten der isolierten Netzhaut oder niedriger Auflösung Bildgebung der Netzhaut mit lebenden Tieren. Hier präsentieren wir eine Methode zur Erzeugung von live ex Vivo retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für live Imaging über konfokalen Mikroskopie. Dieses Präparat liefert Quere Scheiben mit allen Schichten der Netzhaut und die meisten Zelltypen sichtbar für die Durchführung von konfokalen bildgebender Untersuchungen mit Perfusion. Transgene Zebrafisch mit dem Ausdruck ihrer fluoreszierende Proteine oder Biosensoren in bestimmten retinalen Zelltypen oder Organellen sind einzellige Informationsextraktion aus eine intakte Netzhaut verwendet. Darüber hinaus können retinale Scheiben mit fluoreszierenden indikatorfarbstoffen, die Methode Vielseitigkeit hinzu geladen werden. Dieses Protokoll wurde entwickelt für imaging Ca2 + im Zebrafisch-Zapfen-Photorezeptoren, aber mit richtigen Marker könnte es um Ca2 + oder Metaboliten in Müller-Zellen, bipolar und horizontalen Zellen, Mikroglia, amakrinen Zellen oder Retinal Messen angepasst werden Ganglienzellen. Das retinale Pigmentepithel wird aus Scheiben entfernt, so ist diese Methode nicht geeignet für das Studium dieser Zelltyp. Mit etwas Übung ist es möglich, seriellen Scheiben von einem Tier für mehrere Experimente zu generieren. Diese anpassungsfähige Technik ist ein leistungsstarkes Tool für die Beantwortung vieler Fragen über retinale Zellbiologie, Ca2 +und Energie-Homöostase.

Introduction

Der Zebrabärbling (Danio Rerio) hat in medizinischen und grundlegende wissenschaftliche Forschung1, aufgrund seiner geringen Größe, schnelle Entwicklung und vertebrate Organsysteme verbreitet werden. Die natürliche Transparenz des zebrafischlarven in Kombination mit bewährten Methoden für die Transgenese konnten detaillierte Visualisierung zellulärer Prozesse in ein lebendes Tier. Eine Reihe von genetisch codierte fluoreszierende Biosensoren haben spezifische Zebrafisch Zellen zur Erkennung von Ca2 + 2, Wasserstoffperoxid3, apoptotischen Aktivierung4 und ATP5ins Visier genommen.

In-Vivo Bildgebung von zebrafischlarven führte zum Durchbruch auf dem Gebiet der Neurowissenschaften, einschließlich der Zuordnung von Gehirn Schaltungen6 und Arzneimittelentwicklung für zentrale Nervensystem Erkrankungen7. Zebrafisch eignen sich gut für Vision Forschung, weil ihre Netzhaut sind mit laminarer Struktur und Neuron Typen der höheren Wirbeltiere, und sie zeigen robuste visuelle Verhalten8,9. Verschiedene Arten von retinalen Degenerationen analog zur menschlichen Krankheit wurden erfolgreich modelliert und im Zebrafisch10,11, einschließlich live Darstellung der einzelnen Fotorezeptoren degeneriert innerhalb einer Netzhaut-2untersucht, 12.

Während in Vivo Larven Zebrafisch-Bildgebung ein wertvolles Instrument ist, wird es schwieriger, wenn Fische wachsen und sich entwickeln Pigmentierung, und einige pharmakologischen Behandlungen können kein ganzes Tier zu durchdringen. Darüber hinaus ändern bestimmte zelluläre Prozesse mit Entwicklung und Alter, machen spätere Zeitpunkte für Verständnis-Funktion und das Fortschreiten der Krankheit bei erwachsenen Tieren. Biochemische Methoden wie Immunoblot, Quantitiative PCR, O2 Verbrauch und Metabolomic Analysen liefern wichtige Hinweise zur Biologie der Netzhaut als Ganzes, aber es ist schwer zu erkennen, Beiträge der einzelnen Zelltypen betroffen Erkrankung. Isolierte netzhautgewebe ex Vivo Imaging umgeht diese Probleme, und während imaging-flach montierten Netzhaut bietet einen Ausblick auf die äußere Netzhaut13, tiefere inneren Netzhaut Eigenschaften verdunkelt. Transversale Retinal Scheiben, wie die in festen immunhistochemische Analysen einen klaren Überblick über alle Schichten und Zelltypen ermöglichen bieten aber nur eine Momentaufnahme der dynamischen Prozesse in der normalen Funktion und Krankheit.

Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode zur Erzeugung von ex-Vivo quer retinalen Scheiben aus Erwachsenen Zebrafisch für die Bildgebung. Es ähnelt dem Verfahren zur Herstellung von Amphibien und Zebrafisch retinaler Scheiben für elektrophysiologische und morphologische Studien14,15, mit wichtigen Änderungen für Zeitraffer- ex Vivo mit confocal imaging Mikroskopie. Fluoreszenz Antworten von Biosensoren oder Farbstoffen in Scheiben werden in Echtzeit mit einem konfokalen Mikroskop überwacht, während liefern pharmakologische Wirkstoffe mit Perfusion. Während die Methode für die Photorezeptoren imaging entwickelt wurde, kann es, es zu benutzen, zur Visualisierung von Müller-Zellen, Bipolarzellen, horizontalen Zellen, amakrinen Zellen oder retinalen Ganglienzellen mit entsprechenden fluoreszierende Markierungen möglich sein. Darüber hinaus können die Scheiben mit Zelle durchlässig Fluoreszenzfarbstoffen Bericht Zellviabilität, vesikuläre Transport, mitochondriale Funktion oder Redox-Zustand geladen werden. Diese vielseitige Vorbereitung ermöglicht Visualisierung einer breiten Palette von subzellulären Prozessen in der Netzhaut, einschließlich Ca2 + Dynamik, Signaltransduktion und metabolischen Zustand.

Protocol

Alle Tierversuche wurden von der University of Washington institutionelle Animal Care and Use Committee genehmigt. 1. Vorbereitung der Tiere und Ausrüstung Hinweis: Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist ein dunkles Blatt von der Außenseite der Netzhaut deren Pigmentierung kann Netzhaut Funktionen zu verschleiern und schädigen das Gewebe beim konfokale Ex Vivoimaging umgebende Gewebe. Bei Dunkelheit wird die RPE Zebrafisch Weg von der Netzhaut zurückgezoge…

Representative Results

Stabile Positionierung und transversale Ausrichtung der Scheiben sind Schlüssel für erfolgreiche Bildbearbeitung mit Injektion oder Perfusion pharmakologischer Substanzen. Sorgfältig prüfen Sie und positionieren Sie Scheiben vor konfokale Bildgebung zu, wie notwendig, um sicherzustellen, dass alle Schichten der Netzhaut sind sichtbar (Abbildung 2A, Teil Ii). Wenn eine Scheibe gedreht wird leicht nach vorne (Abb. 2A, Slice-Iii…

Discussion

Ex-Vivo Bildgebung frische Zebrafisch retinalen Scheiben erweist sich ein vielseitiges Werkzeug für das Studium Photorezeptor Biologie20,21,22und ist einzigartig, da es ermöglicht Analyse einzelner Zellen in eine Reife, voll differenzierte Netzhaut. Mit etwas Übung ist es möglich, mehrere Experimente mit Gewebe von Fischen, auch mit seriellen Scheiben aus dem gleichen Teil der Netzhaut. Zusätzlich zu den Herausford…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Ralph Nelson und Daniel Possin für durchdachte Beratung bei der Entwicklung dieses Protokoll, und Eva Ma Ashley und George Gail Stanton zur Erzeugung von stabilen transgenen Zebrafisch-Linien. Die Arbeit wurde unterstützt durch NSF GRFP 2013158531, M.G., NIH NEI 5T32EY007031, W.C. und M.G. und EY026020, j.h. und S.B.

Materials

zebrafish Univeristy of Washington South Lake Union Aquatics Facility stocks maintained in-house as stable transgenic lines
petroleum jelly Fisher Scientific 19-090-843 for petroleum jelly syringe
3-mL slip tip syringe Fisher Scientific 14-823-436 for petroleum jelly syringe
20g 3.8 cm slip tip needle Fisher Scientific 14-826-5B for petroleum jelly syringe
plain 7 cm X 2.5 cm microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 for eyecup dissection, slicing chamber
Seche Vite clear nail polish Amazon B00150LT40 for slicing chamber
18 mm X 18 mm #1 glass coverslips Fisher Scientific 12-542A for imaging ladders
unflavored dental wax Amazon B01K8WNL5A for imaging ladders
double edge razor blades Stoelting 51427 for tissue slicing
tissue slicer with digital micrometer Stoelting 51415 for tissue slicing
filter paper – white gridded mixed cellulose, 13 mm diameter, 0.45 µm pore size EMD Millipore HAWG01300 filter paper for mounting retinas
10 cm petri dish Fisher Scientific FB0875712 for fish euthanasia, dissection, imaging ladder assembly
15 cm plain-tipped wood applicator stick Fisher Scientific 23-400-112 for wire eye loop tool
30g (0.25 mm diameter) tungsten wire Fisher Scientific AA10408G6 for wire eye loop tool
D-glucose Sigma Aldrich G8270 component of supplement stock solution
sodium L-lactate Sigma Aldrich L7022 component of supplement stock solution
sodium pyruvate Sigma Aldrich P2256 component of supplement stock solution
L-glutamine Sigma Aldrich G3126 component of supplement stock solution
 L-glutathione, reduced Sigma Aldrich G4251 component of supplement stock solution
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960 component of supplement stock solution
NaCl Sigma Aldrich S7653 component of Ringer's solution
KCl Sigma Aldrich P9333 component of Ringer's solution
CaCl2 · 2H2O Sigma Aldrich C3881 component of Ringer's solution
NaH2PO4 Sigma Aldrich S8282 component of Ringer's solution
MgCl2 · 6H2O Sigma Aldrich M0250 component of Ringer's solution
HEPES Sigma Aldrich H3375 component of Ringer's solution
Tris base Fisher Scientific BP152 component of Na+-free Ringer's solution
6 N HCl Fisher Scientific 02-003-063 component of Na+-free Ringer's solution
KH2PO4 Sigma Aldrich P5655 component of Na+-free Ringer's solution
50 mL conical centrifuge tube Denville Scientific C1062-P container for Ringer's solution
Vannas scissors – 8 cm, angled 5 mm blades World Precision Instruments 501790 micro-scissors for eyecup dissection
Swiss tweezers – #5, 11 cm, straight, 0.06 X 0.07 mm tips World Precision Instruments 504510 fine forceps for eyecup dissection and slice manipulation
single edge razor blades Fisher Scientific 12-640 for eyecup dissection and trimming filter paper
EMD Millipore filter forceps Fisher Scientific XX6200006P flat forceps for handling wet filter paper
C12 558/568 BODIPY Fisher Scientific D3835 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 15 min at room temperature
propidium iodide (PI) Fisher Scientific P3566 stains dead cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Hoechst 33342 Fisher Scientific 62249 stains live cell nuclei; incubate 5 µg/mL for 20 min at room temperature
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Fisher Scientific T668 stains functional, negatively-charged mitochondria; incubate 1 nM for 30 min at room temperature
tissue perfusion chamber Cell MicroControls BT-1-18/BT-1-18BV [-SY] imaging chamber for injection or perfusion
2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (NBDG) Fisher Scientific N13195 fluorescent glucose analog adminitered orally to zebrafish 30 min prior to euthanasia
Olympus laser scanning confocal microscope Olympus FV1000 confocal microscope for visualizing fluorescence of slices at single-cell resolution
Carbonyl cyanide 3-chlorophenylhydrazone (CCCP) Sigma Aldrich C2759 experimental reagent which ablates mitochondrial respiration; treat slices to a final concentration of 1 µM
miniature aspirator positioner Cell MicroControls FL-1 for perfusion
perfusion manifold, gas bubbler manifold, flow valve, 60cc syringe holder Warner Instruments various for perfusion

References

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Citer Cet Article
Giarmarco, M. M., Cleghorn, W. M., Hurley, J. B., Brockerhoff, S. E. Preparing Fresh Retinal Slices from Adult Zebrafish for Ex Vivo Imaging Experiments. J. Vis. Exp. (135), e56977, doi:10.3791/56977 (2018).

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