白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

雄マウスの年齢 8 ~ 12 週間ラインラント = プファルツ州 (承認番号 23 177-07/G12-1-002 と 23 177-07/G15-1-051) から動物実験に倫理委員会の承認の下で古い実験を行った。 1. マウスの麻酔や手術の準備 手術前に良好な健康状態と動物の状態を確認します。術前に体重、食糧や水の消費量だけでなく、全身状態 (外観、姿勢、自発的行動) の 2-3 日に一度動物を監視します。 腹腔内にミダゾラム (5 mg/kg 体重)、メデトミジン (0.5 mg/kg 体重)、フェンタニル (0.05 mg/kg 体重) と麻酔のマスターの組合せを準備 (i. p.) 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/30 g マウスを注入します。 浸透圧ポンプ注入と IVM の実験のための動物の準備は、プラットフォームを温暖化 39 ° C と操作フィールドで実行されます。滅菌消毒風呂のすべてのツール、地球温暖化のプラットフォームを消毒してください。 手続き中に眼軟膏を動物の目を保護します。浸透圧ポンプ注入前にカミソリで毛を削除します。頸動脈と頸静脈カテーテルの注入を IVM 実験の隔離のための脱毛クリームと綿棒を使用します。2 つの皮膚の消毒剤を使用して動物の皮を消毒: 1 つの防腐剤と消毒剤のポビドン ヨードとの 1 つを含む皮膚アルコール ・ ベースのソリューションで防腐剤の含まれている octenidine。 麻酔 (「antisedan ミックス」) atipamezol (0.05 mg/kg 体重) とフルマゼニル (0.01 mg/kgbody 重量) を敵に回したマスター ミックスを調製し皮下に 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/マウスを準備 (サウスカロライナ) 注入。 2. 浸透圧ポンプの準備と移植 注: 浸透圧のポンプを使用して皮下 AngII 注入によって記述されていた詳細に Luら17 滅菌生理食塩水の凍結乾燥粉末を再構成することによって、AngII を準備し、動物の重量とポンプの配信レートで濃度を調整します。プラスチック チューブ (ガラス管を使用していない) に再構成された AngII をしてください。 7 日間の 1 mg/(kg·d) を提供する AngII ソリューションでポンプを入力します。調製後ポンプを維持、4-6 時間滅菌生理食塩水で最低 37 ° C で リア混ぜ麻酔の注射は足の反射と温かみのある操作フィールド上に配置後は、マウスの完全な麻酔をテストします。麻酔導入は 10-15 分かかります、暗い環境で動物を配置している場合、良い作品します。 マウスの腰をそるし、アルコールの皮膚消毒と消毒します。 はさみを使って背骨に垂直な 1 cm の切開を行います。海峡の止血を使用してポンプのためのポケットを作成し、ポンプを挿入 (まず司会の流れ)。ポケット傷口に圧力がないとポンプの自由な移動を許可する必要があります。 炎症; を制限するために縫合糸、およびないクリップで傷を閉じる皮膚消毒剤で消毒します。 Antisedan ミックスを 200 μ l 添加の皮下注射による麻酔の反感を買う、そのケージにマウスを戻ります。 ブプレノルフィンによる術後鎮痛を行う (0.075 mg/kg 皮下) 動物の行動に応じてオンデマンド手術後 1 時間。 3. 頸静脈カテーテル注入と頸動脈の準備 麻酔の注射と後部食品反射を混ぜて位麻酔動物背 recumbence 39 ° C 手術板上軟膏をつけ、温度を維持するために直腸プローブを持つ後マウスの完全な麻酔をテストします。プロシージャの間にそれらを保護するために目。 首毛、脱毛クリームを使用してを削除します。普及し、毛が脱落する開始まで 2 分間クリームをこする綿棒を使用します。さらに 2 分後ヘラでクリームと毛を削除し、アルコールの皮膚消毒で皮膚を消毒します。 顕微鏡下で手術を行います。頸部、気管の横に 1 cm の縦皮膚で 1 〜 1.5 cm の切開を行います。最初の切開の両方の下肢を垂直に他の 2 つの切開を行います。 慎重に皮膚の横にある組織、左内頚静脈と気管を覆っている皮膚の部分を取り外します。 慎重に分離; 耳下腺2 カーブタイプ鉗子と利子のゾーンから舌下腺と顎下腺。カットにまたは損傷腺、頸静脈、頸動脈の最高アクセスを許可するようにそれらを配置しないでください。 頸静脈を分離するには、細い鉗子を使用して、ゆっくりと開き、クローズして周囲の組織から血管を優しく解放します。静脈が完全にきれいになったら容器の下に鉗子を配置し、それの下で 10 cm の 2 つの 7-0 縫合糸を配置します。 2 つの結び目の頭部に近位の縫合を閉じます。その他の縫合の 1 つの結び目を準備が終了しません。 37 ° C; 片手で鉗子を滅菌生理食塩水で満たされたカテーテル (0.61 mm 外径、内径 0.28 mm) を保持します。他の手で、薄いはさみや湾曲した 26 G 針で容器に小切開を確認します。その後、頚静脈にカテーテルを挿入し、2 回結び目を閉じます。完全な固定を確保するために、カテーテルの上頭の近位の縫合を閉じます。 特定し頚動脈を準備するには、区域を薄いカーブタイプ鉗子を使用して気管を解剖します。 頸動脈が周囲の組織から解放されたら、船から (それは頸動脈に隣接する白い線のように見える) 迷走神経を削除 (しかしそれをカットされません)。細い鉗子をクローズし、ゆっくりと優しく神経を動員して開くことができます。 両方の動脈が完全にクリーンな最初の頚動脈下鉗子を置き、船下小黒 3 mm 幅 x 2.5 cm の長さのプラスチック片を配置します。伸び過ぎて血管が血流が容器ホルダーが配置される存在であることを確認する非常に重要です。容器ホルダーに 2 つ目の動脈を置きます。顕微鏡下で直接マウスを挿入しない場合は気管上腺を戻すし、37 ° C ゾーンの乾燥を避けるために滅菌生理食塩水を適用します。 4. ローリングと白血球の付着の評価する LysM + セル IVM の/ アクリジン オレンジ 2 mg/mL 原液-20 ° C で保存からを準備し、それを 1 mL の注射器の滅菌生理食塩水 (最終濃度が 0.5 mg/mL) で 1:4 希釈します。注射器を光から保護し、マウスを一回あたり 200 μ L を使用します。 さまざまな条件をテスト: アクリジン オレンジ頸静脈カテーテル; (1) 注射((この状態で内頸静脈カテーテルが注入なし); 尾外側静脈に直接アクリジン オレンジの注入 2)(3) アクリジン オレンジ蛍光 LysMCre+IRG+を用いたマウス (ここは再び頸静脈カテーテルが注入なし) することがなく測定。 カテーテルは、場所と 2 つの頸動脈が分離、顕微鏡下でマウスを置きます。長距離コンデンサーと 10 X を使用して高速ワイド フィールド蛍光顕微鏡を用いた測定を行う (NA 0.3) 分光器、ビームスプリッター、電荷結合素子カメラと水浸対物レンズです。画像の獲得およびリアルタイム イメージング システムの分析を実行します。 血管内皮細胞表面で頸動脈の真ん中に対物レンズの焦点を合わせます。アクリジン オレンジの 50 μ L (0.5 mg/mL) (最初の注入用カテーテルのデッド ボリュームを考慮に入れなさい) をゆっくりと注入します。画像ごとに 120 ミリ秒の露光時間で 100 の画像を記録するソフトウェアを設定します。 各ビデオの動脈上の異なる場所で内頚動脈 (左と右) あたりの 4 つのビデオを作る。蛍光信号が小さくなる場合は、アクリジン オレンジの別の 50 μ L を挿入します。 すべてのビデオを記録した後頚部転位によって、動物を安楽死させます。 毎秒 10 枚で動画の速度を設定して各ビデオの容器の中央に置かれた 200 μ x 250 μ m 四角形ビューでローリングと付着性細胞を定量化します。ローリングと付着性のセルを数える;付着性のセルは、セルを移動しない、または 10 の s ビデオ内血管内皮細胞からデタッチとして定義されます。定量化を簡素化し、赤い蛍光を用いたチャネルを削除し、ローリングと付着細胞をカウントする緑の蛍光性を使用します。 アクリジン オレンジを用いた実験では、血管内皮細胞によって作られたバック グラウンドを除去するために蛍光性の手動によるしきい値を確認します。