En förbättrad metod för insamling av ryggmärgsvätska från sövda möss
Summary
Det här protokollet beskriver en förbättrad teknik för riklig insamling av cerebrospinalvätska (CSF) med ingen förorening från blodet. Med större provsamling och renhet, kan fler analyser utföras med CSF för att vidareutveckla vår förståelse av sjukdomar som påverkar hjärnan och ryggmärgen.
Abstract
Cerebrospinalvätska (CSF) är en värdefull kroppen vätska för analys i neurovetenskap forskning. Det är en av vätskorna i närmaste kontakt med centrala nervsystemet och således kan användas för att analysera tillståndet sjuka i hjärnan eller ryggmärgen utan direkt tillgång till dessa vävnader. Dock i möss är det svårt att få från cisterna magna på grund av dess närhet till blodkärlen, vilket ofta förorena prover. Området för CSF samling hos möss är också svårt att dissekera till och ofta endast små prover erhålls (maximalt 5-7 µL eller mindre). Detta protokoll beskriver i detalj en teknik som förbättrar den nuvarande metoder för att minimera kontaminering från blod och tillåta för riklig insamling av CSF (i genomsnitt 10-15 µL kan samlas). Denna teknik kan användas med andra dissektion metoder för insamling av vävnad från möss, eftersom det inte inverkar alla vävnader under CSF extraktion. Således, hjärnan och ryggmärgen påverkas inte med denna teknik och förbli intakt. Med större CSF-provtagning och renhet, fler analyser kan användas med denna vätska att ytterligare stöd neurovetenskapliga forskning och bättre förstå sjukdomar som drabbar hjärnan och ryggmärgen.
Introduction
CSF är en värdefull kroppen vätska för analys i neurovetenskap forskning. CSF är huvudsakligen tillverkade av blodplasma, som innehåller några celler (inga röda blodkroppar och endast några vita blodkroppar) och är nästan fritt från protein. Det är en av vätskorna i nära kontakt med det centrala nervsystemet (CNS) och det kan passera många elektrolyter från hjärnan och ryggmärgen till perifera systemet. I människor, CSF prover kan samlas till stöd i diagnos av sjukdom eller för forskningsändamål i kliniska prövningar, som spinal tap (eller lumbalpunktion) är en mindre, invasiv procedur: CSF vätskan kan återspegla förändringar i CNS utan att direkt få tillgång till dessa vävnaderna. Således, under de senaste åren, för forskningsändamål i kliniken, CSF prover har erhållits från patienter med neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom och andra demenssjukdomar1,2,3. I området i närheten finns det många biomarkör-analyser som har utvecklats med hjälp av CSF prover till potentiellt stöd för att diagnostisera sjukdomar i klinik2,3. Det finns dock mycket debatt om tillförlitligheten av dessa analyser att producera konsekventa och känsliga resultat för att specifikt diagnostisera sjukdom4,5. Så, finns det ett stort behov för utveckling av bättre analyser och mål, som kan hittas i CSF, till stöd i att producera en standardiserad teknik att diagnostisera neurodegenerativa sjukdomar med större känslighet och specificitet. På grund av den potentiella betydelsen av mänskliga CSF prover vid sjukdom är insamling av CSF från gnagare i neurovetenskap forskning också av intresse.
Möss är viktiga djur i biologisk och medicinsk forskning och möjliggör testning av potentiella terapeutiska föreningar och proof-of-concept studier innan kliniska prövningar. Hos möss är det dock svårt att erhålla CSF prover på grund av dess närhet till hjärnan i ett litet djur, som den vanliga metoden för CSF insamling hos möss är att få det via cisterna magna, en öppning mellan lillhjärnan och dorsala ytan av förlängda märgen. Detta medför svårigheter att samla in CSF prover eftersom detta område är svårt att dissekera till och i nära närhet till blodkärlen, ökar risken för kontaminering från blodkroppar. På grund av dessa svårigheter, de flesta forskare kan endast få en liten mängd av CSF för analys (oftast anges som 5-7 µL) och kontaminering av CSF prover av blodkroppar är en huvudfråga för analyser6,7,8 , 9. blod kontaminering kan skymma resultat och inte verkligen återspeglar tillståndet i CNS. Dessutom begränsat urvalet samlat kan påverka forskning som den vanliga mängden insamlade från möss är nog för endast en mätning (i två eller tre exemplar) använder enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Således, sammanförs vanligtvis CSF prover från flera möss för att ha tillräckligt prov köra flera analyser. Utveckla ett protokoll för den rikliga, oförorenad samling av CSF från möss önskas kraftigt och kommer att vara fördelaktigt att förbättra neurovetenskapliga forskning med hjälp av gnagare.
I detta protokoll, en teknik för den rikliga (ett genomsnitt på 10-15 µL) samling av CSF från sövda möss beskrivs i detalj och förbättrar en nu kända metoden för CSF insamling att minimera kontaminering från blod10. Ett robust protokoll för CSF samling kommer stöd i utvecklingen av CSF-baserade biomarkör analyser, som skulle kunna användas till stöd för att diagnostisera sjukdomen, samt förbättra forskningen till de mekanismer som ligger bakom sjukdomar som drabbar CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll i detalj beskriver en teknik som förbättrar den nuvarande metoder10 av CSF samling att minimera kontaminering från blod och tillåta för riklig insamling av CSF (i genomsnitt ~ 10-15 µL kan erhållas) från möss. När du bryter kapillär spetsen, spetsen av kapillären inte bör vara för liten (som då GSR extraheras mycket långsamt) eller för stor (kommer inte är fina nog att samla GSR och vävnad kan fastna i kapillären). Försiktighet bör iakttas när dissekera områ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation Kina (81650110527, 81371400) och nationella nyckel grundläggande forskning Program av Kina (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
