En forbedret metode for samling av cerebrospinalvesken fra bedøvet mus
Summary
Denne protokollen beskriver en forbedret teknikk for rikelig innsamling av cerebrospinalvæske (CSF) med ingen forurensning fra blodet. Med større prøvetaking og renhet, kan flere analyser utføres med CSF for å fremme vår forståelse av sykdommer som påvirker hjernen og ryggmargen.
Abstract
Cerebrospinalvæske (CSF) er en verdifull kroppen væske for analyse i nevrovitenskap forskning. Det er en av væsker i nærmeste kontakt med sentralnervesystemet og dermed kan brukes til å analysere syke statusen til hjernen eller ryggmargen uten direkte tilgang til disse vev. Men i mus er det vanskelig å få fra cisterna magna på grunn av sin nærhet til blodårene, som ofte forurense prøver. Området for CSF samling i mus er også vanskelig å dissekere til og ofte bare små utvalg hentes (maksimum 5-7 µL eller mindre). Denne protokollen beskriver i detalj en teknikk som forbedrer gjeldende metoder for samling å redusere forurensning fra blod og tillate rikelig samlingen av CSF (i gjennomsnitt 10-15 µL kan samles). Denne teknikken kan brukes med andre disseksjon metoder for vev samling fra mus, så det ikke påvirker noen vev under CSF utvinning. Dermed hjernen og ryggmarg påvirkes ikke med denne teknikken og forblir intakt. Med større CSF prøvetaking og renhet, flere analyser kan brukes med denne flytende ytterligere hjelp nevrovitenskap forskning og forstå sykdommer som påvirker hjernen og ryggmargen.
Introduction
CSF er en verdifull kroppen væske for analyse i nevrovitenskap forskning. CSF er hovedsakelig laget av blod plasma, som inneholder noen celler (ingen røde blodlegemer og bare et par hvite blodlegemer) og er nesten protein-fri. Det er en av væsker i nær kontakt med sentralnervesystemet (CNS) og det kan gå mange elektrolytter fra hjernen og ryggmarg til det eksterne systemet. Hos mennesker, CSF prøver kan samles som hjelp til å diagnostisere sykdom eller til forskningsformål i kliniske forsøk, som popbransjen (eller lumbale punktering) er en mindre, invasiv prosedyre: CSF væsken kan gjenspeile endringer i CNS uten å direkte tilgang vev. Dermed de siste årene, for forskningsformål i klinikken, er CSF prøver anskaffet fra pasienter av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom og andre dementias1,2,3. Det er mange biomarkør analyser som har blitt utviklet ved hjelp av CSF prøver for å hjelpe diagnostisere sykdommer i klinikken2,3. Men er det mye debatt på påliteligheten av disse analyser å produsere konsistente, følsom resultater å spesielt diagnostisere sykdom4,5. Så, det er et stort behov for utvikling av bedre analyser og mål, som finnes i CSF, som hjelp til å produsere en standard teknikk å diagnostisere nevrodegenerative sykdommer med større sensitivitet og spesifisitet. På grunn av potensielle viktigheten av menneskelig CSF prøver i sykdom er samlingen av CSF fra gnagere i nevrovitenskap forskning også av interesse.
Mus er viktig dyr i biologisk og medisinsk forskning og lar for testing av potensielle terapeutiske forbindelser og proof-of-concept studier før kliniske studier. Men i mus er det vanskelig å få CSF eksempler på grunn av sin nærhet til hjernen i en liten dyr, som den vanlige metoden av CSF samling i mus er å få det via cisterna magna, en åpning mellom lillehjernen og dorsal overflaten av forlengede. Dette fører i samle CSF eksempler som dette området er vanskelig å dissekere til og i nærheten blodkar, øker risikoen for forurensning fra blod celler. Disse vanskelighetene, de fleste forskere kan bare få en liten mengde CSF for analyse (vanligvis oppgitt som 5-7 µL) og forurensning av CSF prøver av blod celler er et hovedanliggende for analyser6,7,8 , 9. blod forurensning kan skjule resultater og ikke virkelig gjenspeiler tilstanden til CNS. Videre begrenset utvalg samlet kan påvirke forskning som vanlig beløp fra mus er nok for bare ett mål (i duplikat eller tre eksemplarer) bruker enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). Dermed er CSF prøver vanligvis samlet fra flere mus for å ha nok prøve å kjørt flere analyser. Utvikle en protokoll for de rike, forurenset samling av CSF fra mus er sterkt ønsket og vil være gunstig å bedre nevrovitenskap forskning ved hjelp av gnagere.
I denne protokollen, en teknikk for den rike (et gjennomsnitt på 10-15 µL) samling av CSF fra bedøvet mus er beskrevet i detalj og forbedrer kjente metode av CSF samling å redusere forurensning fra blod10. En robust protokoll for CSF samling hjelper i utviklingen av CSF-baserte biomarkør analyser, hvilke kan brukes å hjelpe diagnostisere sykdom, samt forbedre forskning i mekanismer underlie sykdommer CNS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver i detalj en teknikk som forbedrer på gjeldende metoder10 av CSF samling å redusere forurensning fra blod og tillate rikelig samlingen av CSF (gjennomsnittlig ~ 10-15 µL fås) fra mus. Når bryte kapillær spissen, spissen av av kapillær bør ikke være for liten (som da CSF vil trekkes veldig sakte) eller for stor (vil ikke bli fint nok å samle CSF og vev kan bli lodged i av kapillær). Forsiktighet bør utvises når dissekere området for CSF samling: blødninger …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation i Kina (81650110527, 81371400) og National nøkkelen grunnleggende forskning Program i Kina (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
