Summary

麻酔下のマウスから脳脊髄液のコレクションのための改良法

Published: March 19, 2018
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Summary

このプロトコルではない汚染血液から脳脊髄液 (CSF) の豊富なコレクションのための改善された技術について説明します。大きいサンプル コレクションと純度で、脳や脊髄に影響を与える病気の私達の理解を促進するため CSF を使用してより分析を実行できます。

Abstract

脳脊髄液 (CSF) は、神経科学研究の分析のための貴重な体液です。それは流体の 1 つは、最も身近な中枢神経系、したがって、これらの組織に直接アクセスしなくても脳や脊髄の病気の状態を分析する使用できます。ただし、マウス血管への近さのため槽から取得することは困難だ、これはしばしば、サンプルを汚染します。マウスにおける CSF コレクションのエリアもに解剖することは困難、(最大 5 7 μ l 以下) に頻繁にだけ小さいサンプルが得られます。このプロトコルは、血液からの汚染を最小限にし、(1 日平均 10-15 μ L を収集できる) CSF の豊富なコレクションは、コレクションの現在の方法を改善する技術を詳しく説明します。この手法は、CSF の抽出時に任意の組織は影響しません、マウスから組織の採取その他の郭清方法で使用できます。したがって、脳と脊髄をこの手法で受けず、そのまま。大きい CSF 標本と純度より分析はこのさらに流体援助神経科学研究で使用できるし、脳と脊髄に影響を与える疾患を理解します。

Introduction

脳脊髄液は神経科学研究の分析のための貴重な体液です。CSF (ない赤血球とだけいくつかの白い血液細胞) 数の細胞を含む血液の血漿から作られた主、ほとんどタンパク質無料します。中枢神経系 (CNS) と密接な接触で流体の一つだ、それは周辺システムに脳と脊髄からの多くの電解質渡すことができます。ヒトでは、CSF サンプル病の診断で支援するために収集することができますまたは臨床試験で研究目的のため脊髄をタップ (または腰椎穿刺) としてはマイナーな侵襲的なプロシージャ: CSF 流体は、これらに直接アクセスすることがなく中枢神経系に対する変更を反映できます組織。したがって、近年、診療所の研究目的のためアルツハイマー病や他の痴呆1,2,3などの神経変性疾患の患者から髄液のサンプルを得られています。潜在的クリニック2,3で病気の診断を支援するため髄液のサンプルを使用して開発している多くのバイオ マーカー分析があります。ただし、病4,5を具体的に診断する機密性の高い、一貫性のある結果を生成するこれらのアッセイの信頼性に関する多くの議論があります。だから、高い感度と特異性の神経変性疾患を診断する標準的な技術の生産を支援するより良いアッセイおよび CSF で見つけることができる、ターゲットの開発のための大きい必要があります。病気の人間の脳脊髄液サンプルの潜在的な重要性、神経科学研究の齧歯動物から CSF のコレクションも興味のです。

マウスは医学生物学の重要な動物のおよび潜在的な治療上の化合物とひと臨床試験の前に概念実証研究のテストを可能にします。マウスのそれは、小動物では、脳への近さのため髄液のサンプルを得ることが困難槽は、小脳と延髄の背側表面の開口部を介して取得するマウスにおける CSF コレクションの通常の方法は。これにより、難易度を分析することは困難は脳脊髄液サンプルを収集し、血液細胞からの汚染のリスクを増加させる、血管に近接。これらの難しさのためほとんどの研究者が分析 (通常 5-7 μ として記載) のため髄液の少量を取得できるだけで、血液細胞による CSF 試料の汚染分析6,7,8の最大の関心事,9. 血液汚染することができます結果を隠すし、本当に中枢神経系の状態を反映します。マウスから収集された量は、通常は (重複 3 通の) 1 つだけ測定のために十分に、限られたサンプルの収集研究を影響さらに、酵素免疫測定法 (ELISA) を使用します。したがって、脳脊髄液のサンプルは通常、十分なサンプルを複数のアッセイを実行するために複数のマウスからプールされます。豊富なプロトコルを開発、マウスから脳脊髄液の汚染されていないコレクション目的と大きくとげっ歯類を用いた神経科学研究の改善に有益になります。

このプロトコルでは、豊富な技術で (10-15 μ L の平均) 麻酔下マウスから CSF のコレクションで詳しく説明し、CSF コレクション血10からの汚染を最小限に抑えるための現在知られている方法の改善します。CSF のコレクションのための堅牢なプロトコルは、病を診断するに役立つだけでなく、中枢神経系に影響を与える疾患の根底にあるメカニズムに研究を向上させるために使用できるバイオ マーカーの CSF ベースの試金の開発に役立ちます。

Protocol

すべての動物実験を神経科学 (アメリカ)、復旦大学 (中国・上海) 倫理委員会の学会の方針に基づき行った。この手順は、生存非手術です。 1. CSF コレクション装置のセットアップ ガラスの毛細管を引く (内径 0.75 mm、外径 1.0 mm) (劉らのように、マイクロ ピペットの引き手を使用10;シャープのキャピラリーは、図 1に?…

Representative Results

(図 1および図 2) ここで説明する手順を使用して、すぐに毛細血管で収集した CSF は、ピンクや赤ではなく、クリア (図 2 e) をする必要があります。毛細血管に収集流体に赤い色合いをピンク、血液の混入があった。 CSF のサンプルのアプリケーションの例?…

Discussion

このプロトコルを記述する詳細に CSF 血からの汚染を最小限に抑え、CSF の豊富なコレクションでは、コレクションの現在の方法10向上させる手法 (平均 ~ 10-15 μ L を得ることができる) マウスから。キャピラリーの先端は小さすぎる (と、脳脊髄液が抽出されます非常にゆっくり) ならない先端部にキャピラリーを壊すときや大きすぎる (脳脊髄液を集めるための罰金し、組織?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、国家自然科学基金、中国の (81650110527, 81371400) とキー基本的な研究プログラムの中国国家 (2013CB530900) によって支持されました。

Materials

Chloral hydrate (used as anesthetic) Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. 30037517 CAS number 302-17-0.
Dissecting scissors 66 vision technology 54002
Dissecting curved forceps 66 vision technology 53072
Dissecting straight forceps 66 vision technology 53070
Mouse adapter (with ear bars) Made in-house. N/A Similar equipment available from World Precision Instruments.
Dissecting microscope Meiji Labax Model 15381
Micromanipulator World Precision Instruments M3301
Magnetic base for micromanipulator Kanetec MB-K
Glass capillaries World Precision Instruments 1B100-4
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-1000
Syringes (1ml) Tansoole 02024692 For 1ml.
Microtubes (1.5ml) Axygen MCT-150-C
Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free Calbiochem 539134
Human Aβ42 ELISA kit Invitrogen KHB3441
Piping (teflon tubing) World Precision Instruments MMP-KIT Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe.
Mini centrifuge Tiangen Biotech OSE-MC8
Cotton buds Obtained from any household store/pharmacy. N/A

References

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Citer Cet Article
Lim, N. K., Moestrup, V., Zhang, X., Wang, W., Møller, A., Huang, F. An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice. J. Vis. Exp. (133), e56774, doi:10.3791/56774 (2018).

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