جمع واستخراج عينات من الهواء المهنية لتحليل الحمض النووي الفطرية
Summary
تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة طريقة تستخدم في الدراسات الصحية المهنية لتحديد المخاطر الصحية. ويصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي من عينات الهواء المهنية للتضخيم وتسلسل الفطرية للبحث عن المناطق. هذا النهج يكشف العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن التغاضي عنها بأساليب التقييم التقليدية.
Abstract
الأساليب التقليدية لتحديد التعرض الفطرية في البيئات المهنية، مثل الثقافة والنهج القائم على الفحص المجهري، لديها العديد من القيود التي أدت إلى استبعاد العديد من الأنواع. وقد أدت التطورات في هذا المجال على مدى العقدين الماضيين الباحثين في مجال الصحة المهنية إلى التحول إلى النهج المستندة إلى الجزيئية لتحديد المخاطر الفطرية. وأدت هذه الأساليب في الكشف عن العديد من الأنواع داخل البيئات الداخلية والمهنية التي لم يتم اكتشاف باستخدام الأساليب التقليدية. تفاصيل البروتوكول هذا نهج لتحديد التنوع الفطرية داخل الهواء عينات عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي والتضخيم وتسلسلها والتعريف التصنيفي للفطريات الداخلية نسخها مناطق فاصلة (البحث عن). نتائجه التسلسل في الكشف عن العديد من الأنواع الفطرية التي غير المكتشفة أو صعوبة في التعرف على مستوى الأنواع باستخدام الثقافة أو مجهرية. في حين أن هذه الأساليب لا توفر التدابير الكمية من عبء الفطرية، أنها توفر نهجاً جديداً لتحديد المخاطر ويمكن استخدامها لتحديد ثراء الأنواع العامة والتنوع داخل بيئة مهنية.
Introduction
يمكن أن يؤدي التعرض الفطرية في البيئات الداخلية والمهنية المراضات الجهاز التنفسي، بما في ذلك التوعية بالحساسية والربو1. من المهم تحديد المخاطر الفطرية لتقييم المخاطر ومنع تعرض العمال. قد تكون هذه المخاطر الفطرية نتيجة لتلوث داخلي، تسرب الهواء الخارجي، أو الاضطرابات البيئية تؤدي إلى نقل المواد الفطرية في المناطق التي تكون فيها العمال الحالي2. وشملت الأساليب لتقييم التعرض الفطرية العينات الثقافة قابلة للاستمرار، فضلا عن تحديد مجهرية من الجراثيم الفطرية. هذه النهج العديد من القيود وغالباً ما تتجاهل العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن أن تسهم في عبء الفطرية عموما3. يمكن تمييز النهج المستندة إلى الثقافة فقط تلك الكائنات الفطرية قابلة للتطبيق التي يمكن زراعتها في وسائل الإعلام المغذيات. يمكن مرتبك تحديد الجراثيم الفطرية على مستوى الأنواع عن طريق الفحص المجهري بجراثيم تقاسم مورفولوجيس مماثلة. كلتا الطريقتين تعتمد اعتماداً كبيرا على ميكولوجيستس لتحليل وتحديد الأنواع الفطرية، مع العديد من تبقى مجهولة.
ولتحسين المنهجيات الحالية المستخدمة في تحديد المخاطر المهنية وتقييم التعرض، تحولت العديد من الباحثين للتقنيات الجزيئية. وقد كشفت عن النهج القائم على التسلسل لتقييم التنوع الميكروبي داخل البيئات الداخلية والمهنية نطاقا أوسع من الأنواع الفطرية التي واجهت مقارنة بأساليب مثل الفحص المجهري والثقافة قابلة للتطبيق3،4 ،5. ويصف الطريقة المعروضة هنا عينات الهواء من البيئات المهنية واستخراج الحمض النووي للتعرف على الإخطار المحتملة الفطرية. ويتم إنجاز تحديد المخاطر بالتسلسل النووي ريبوسومال مباعدة يدون الداخلية، أو للبحث عن، المناطق اختلافاً كبيرا بين الفطريات واستخدمت عادة للتمييز بين الأنواع الفطرية6،7، 8،9. العديد من الأنواع الموجودة في إعدادات المهنية، مثل بعض الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات باسيديوميكوتا، لا يمكن تبينه في الثقافة قابلة للحياة ومن الصعب التفريق بين مجهريا. لوحظت هذه الفطريات في الوفرة النسبية عالية داخل البيئات الداخلية والمهنية المقررة حسب تسلسلها الفطرية للبحث عن مناطق3،،من410. وقدمت لها تسلسل معرفة أكبر إلى تنوع الفطريات مصادفة داخل البيئات الداخلية والمهنية.
ووصف البروتوكول هنا تفاصيل الطرق المستخدمة لجمع واستخراج، وتضخيم الفطرية للبحث عن مناطق من بيوايروسولس لتحليل تسلسل. وهذا النهج يستخدم المعهد الوطني “السلامة المهنية” والصحة (هي) الإعصار مرحلتين الأيروسول العينات لجمع الجسيمات في الهواء. ووضعت هذه العينات لجمع بيوايروسولس ومنفصلة للاستنشاق (دي فور القطر الأيرودينامية ميكرومتر) وغير للاستنشاق (> 4 ميكرومتر الأيرودينامية القطر) الجسيمات، التي تسمح بتحديد هوية الكائنات الفطرية داخل البيئات المغلقة التي أكثر يحتمل أن يكون استنشاقه بعامل11. تتوفر العينات الجوية الأخرى، بما في ذلك أخذ العينات من الإعصار، في الأسواق التي لديها القدرة على جمع الجسيمات داخل النطاق للاستنشاق (< 4 ميكرومتر) باستخدام عوامل تصفية12،13. وفي المقابل، يفصل عينات الأيروسول إعصار مرحلتين هي الأنواع الفطرية استناداً إلى طول القطر الأيرودينامية في أنابيب المتاح، والبولي بروبيلين الذي يمكن معالجته فورا لطلبات المتلقين للمعلومات14.
ترد تفاصيل عمليات استخراج الحمض النووي وتضخيم للبحث عن المناطق الفطرية في هذا البروتوكول. وضعت منهجيات الاستخراج المقدمة خصيصا لاستخراج الحمض النووي من الفطريات والبكتيريا، كما العديد من مجموعات تجارية تستهدف خلايا الثدييات، والبكتيريا، أو على وجه التحديد الخمائر15. يتم اختيار أجهزة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة تستند على التغطية الشاملة لكل 1، الفطرية والمناطق 2،4،5. يسمح وضع تسلسل لهذه المناطق للمقارنة بين العديد من تسلسل للبحث عن راهن، بما في ذلك التسلسل المنطقة 1، أو 2 في منطقة أو مناطق كل من 1، و 2،. تنوع الفطرية لعينات من الهواء جمعت في استخدام الإعداد داخلي تظهر هذه الأساليب، الكشف عن عدد كبير من تسلسلات وضعها في يعج أسكوميكوتا وباسيديوميكوتا، فضلا عن تسلسلات أخرى تنتمي إلى أقل المهيمنة يعج الفطرية، مثل زيجوميكوتا. أن لم يتم التقاط التنوع الكبير في تسلسل الفطرية المحددة باستخدام هذا النهج باستخدام منهجيات تحديد المخاطر التقليدية مثل الزراعة أو الفحص المجهري. تسلسل الفطرية للبحث عن مناطق توفر طريقة محسنة تحديد المخاطر الفطرية وتسمح بفهم أفضل للتعرض الفطرية داخلي والمهنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة مهنية باستخدام النهج القائم على التسلسل تحسن تقييم المخاطر الفطرية بتحديد الهوية والتعرض. وقد يسمح باستخدام هذا النهج للكشف عن العديد من الأنواع الفطرية الإضافية التي غالباً ما لا يتم الكشف عن استخدام الثقافة أو أساليب التقييم القائم على الفحص المجهري. طري…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا اتفاق مشترك بين الوكالات هي بين نيس (AES12007001-1-0-6).
Materials
| NIOSH BC251 bioaerosol cyclone sampler | NIOSH | BC251 | The NIOSH sampler is not yet commercially available. Please contact William Lindsley, PhD (wlindsley@cdc.gov) for information on obtaining the NIOSH sampler |
| Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-373 | 1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes for air sampling; screw top threading must match the threading of the NIOSH sampler |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Corning | 352096 | 15 mL polypropylene tubes for air sampling |
| Clean Room Vinyl Tape, Easy-Remove, 1/4" Width | McMaster-Carr | 76505A1 | sealing tape |
| Filter Cassette, Clear Styrene, 37 mm | SKC Inc. | 225-3LF | 3-piece sampling cassette (no filter). Contains: cassette base, extension cowl, cassette cap and inlet/outlet plugs |
| PTFE hydrophobic fluoropore membrane filters, 3.0 µm, 37 mm | EMD Millipore | FSLW03700 | Contains: 37 mm, 3.0 µm PTFE filters and support pads |
| Fisherbrand filter forceps | Fisher Scientific | 09-753-50 | filter forceps |
| Model 502 Precision PanaPress | PanaVise | 502 | pneumatic cassette press is constructed from this precision arbor press |
| Scotch Super 33+ vinyl electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | 19 mm tape |
| Multi-purpose Calibration Jar, Large | SKC Inc. | 225-112 | calibration jar |
| Universal PCXR4 Sample Pump | SKC Inc. | 224-PCXR4 | sampling pump |
| Mass Flowmeter 4140 | TSI Inc. | 4140 | flow meter |
| Roche High Pure PCR Template Kit | Roche Diagnostics | 11796828001 | Kit used for genomic DNA extraction. Contains: Lysis buffer, Binding buffer, Proteinase K, Inhibitor removal buffer, Wash buffer, Elution buffer, Glass fiber filter tubes and 2 ml collection tubes |
| Fisherbrand 2 mL Reinforced Polypropylene Screw Cap Tubes with Caps | Fisher Scientific | 15340162 | 2 mL reinforced tubes for bead homogenization |
| Glass beads, acid washed, 212-300 µm | Sigma-Aldrich | G1277 | glass beads |
| Fisher Scientific Bead Mill 24 Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | bead homogenizer |
| CelLytic B Cell Lysis Reagent, 10X | Sigma-Aldrich | C8740 | lysis reagent |
| Platinum Taq polymerase | Invitrogen | 10966-018 | Contains: Platinum Taq polymerase, 10X PCR buffer (no MgCl2), 50 mM MgCl2, KB Extender |
| dNTP Mix | Invitrogen | 18427-088 | 10 mM dNTP mix |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Kit used to purify fungal amplicons. Contains: Buffer PB (binding buffer), Buffer PE (washing buffer), Buffer EB (elution buffer), pH Indicator dye (optional), and GelPilot loading dye |
| Owl EasyCast Mini Gel Electrophoresis System | Thermo Fisher | B1 or B2 | |
| TrackIt 1 KB Plus DNA Ladder | Thermo Fisher | 10488-085 | DNA ladder |
References
- Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
- Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
- Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
- Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
- Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28 (2005).
- Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
- Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629 (2014).
- Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863 (2012).
- Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
- Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
- Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
- Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308 (2015).
- Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
- Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
- ACGIH. . Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , (2001).
- Rodes, C. E., Thornburg, J. W., Ruzer, L. S., Harley, N. H. . Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. , (2005).
- Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
- Couch, J., et al. . Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , (2017).
- Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
- Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
- Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189 (2010).
- Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
- Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).
