Mise en place d’une plateforme de criblage à haut débit afin d’évaluer l’hétérogénéité d’Amplification de gène HER2 dans les Cancers du sein
Summary
Une distribution hétérogène de cellules HER2-positif peut être observée dans un sous-ensemble des cancers du sein et génère des dilemmes cliniques. Ici, nous introduisons un protocole fiable et rentable pour définir, quantifier et comparer HER2 une hétérogénéité génétique intra-tumeur dans une grande série de cancers du sein traités de façon hétérogène.
Abstract
Des thérapies ciblées contre le récepteur de facteur de croissance épidermique humain (HER2) de 2 ont changé radicalement les résultats des patients atteints de cancers du sein HER2-positif. Cependant, une minorité de cas affiche une distribution hétérogène de cellules HER2-positif, qui génère des défis cliniques majeurs. A ce jour, aucun protocole fiable et standardisé pour la caractérisation et la quantification des hétérogène amplification de gène HER2 dans des cohortes n’ont été proposées. Nous présentons ici une méthode de haut débit afin d’évaluer en même temps le statut HER2 dans différentes zones topographiques de plusieurs cancers du sein. En particulier, nous illustrons la procédure de laboratoire pour construire des microarrays de tissu amélioré (TMA) incorporant un mappage ciblé des tumeurs. Tous les paramètres TMA ont été spécialement optimisés pour l’hybridation d’argent in situ (SISH) fixés au formol les tissus mammaires (FFIP) inclus en paraffine. L’analyse immunohistochimique des biomarqueurs pronostiques et prédictifs (c.-à-d., ER, PR, Ki67 et HER2) doit être effectuée à l’aide de procédures automatisées. Un protocole SISH personnalisé a été appliqué pour permettre une analyse moléculaire de haute qualité à travers de nombreux tissus qui ont subi des procédures de fixation, de traitement et de stockage différentes. Dans cette étude, nous fournissons une preuve du principe que les séquences d’ADN spécifiques pourraient être cancers mammaires simultanément localisées dans des zones distinctes de topographiques de multiple et hétérogène transformés à l’aide d’une méthode efficace et rentable.
Introduction
HER2 est un proto-oncogène qui est surexprimé et amplifié dans 15 à 30 % de tous les invasive breast cancer1,2. La surexpression de HER2 est déduite par la présence de > 10 % des cellules avec membrane forte immunohistochimie (IHC) coloration (3 +), tandis que l’amplification de gène peut être évaluée lorsque le ratio de HER2/centromère est ≥ 2 ou que le nombre de copies du gène est ≥6, sur le comptage au moins 20 cellules par in situ hybridation (ISH)3.
Une hétérogénéité génétique intra-tumeur a été largement décrite dans les cancers du sein, étant un contributeur néfastes à l’évaluation de biomarqueurs et traitements réponse4. Selon le College of American Pathologists (CAP), hétérogénéité HER2 existe si HER2 est amplifié chez > 5 % et < 50 % d’infiltration tumorale sériés5. Malheureusement, l’incidence réelle de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein reste un sujet de controverse entre les pathologistes, avec certains auteurs soutenant que c’est un événement extrêmement rare, et d’autres suggérant que jusqu’à 40 % des cas sont HER2-hétérogènes1,5,6,7,8,9,10. Malgré les mécanismes biologiques qui sous-tendent cette condition sont pas encore totalement clarifiées, les effets cliniques et pronostiques de l’hétérogénéité intra-tumeurs HER2 sont cruciales pour breast cancer patients11.
Récemment, lumineux-zone des techniques moléculaires, comme chromogène ISH (CISH) et argent ISH (SISH), étaient devenus des méthodes fiables pour détecter les HER2 hétérogénéité dans les tissus FFIP, avec quelques avantages par rapport aux fluorescents ISH (poisson)12. Malheureusement, l’analyse en vrac des cas unique reste impraticable dans les études de cohorte importante. Plusieurs groupes ont suggéré que la combinaison d’histochimie, IHC et ISH avec technologies TMA pourrait constituer une stratégie utile dans l’étude du cancer biology13,14,15,16. Avec cette méthode largement adoptée, des échantillons de tissus provenant de patients différents peuvent être analysés en même temps, réduisant au minimum le tissu et les réactifs utilisés et favorisant ainsi l’analyse uniforme d’une grande série de cas14. Cependant, aucun des protocoles ne sont disponibles pour la caractérisation moléculaire simultanée de haut débit de plusieurs échantillons de tissus qui a subi une transformation différente en termes de réactifs, temps de fixation et des méthodes de conservation indépendants, par exemple sous le nom d’archives pâtés de maisons.
Étant donné les implications pronostiques et cliniques de l’hétérogénéité spatiale HER2 dans les cancers du sein, nous avons développé une plateforme intégrée moléculaire pour évaluer en grande série de cas hétérogène transformés. Ici, nous dépeindre les stratégies de laboratoire pour générer et analyser l’hétérogénéité intra-tumorale de HER2 amplification dans la TMA de rendement élevé de cancer du sein au moyen de l’ES. Le protocole suivant a été développé pour les tumeurs mesurant > 5 mm (> pT1b selon la classification TNM 2017)17. Pour les lésions plus petites, nous recommandons de procéder l’analyse sur des coupes sériées intégral. Notre procédure permet l’analyse simultanée d’IHC et recueillent des jusqu’à 30 cancers du sein, qui englobe une moyenne de 6 zones distinctes (intervalle de 4 à 8) pour chaque cas. Au total, 180 carottes de tissu de 1 mm de diamètre, avec 500 µm entre les noyaux et de 2 mm entre la grille et les bords seront générés pour chaque bloc TMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons détaillé les stratégies de laboratoire pour effectuer les analyses SISH du gène HER2 et son centromère correspondante dans la TMA de rendement élevé des cancers du sein traités de façon hétérogène. Cette méthode est rentable et peut être effectuée dans la plupart des laboratoires pour l’étude de l’hétérogénéité amplification du gène HER2 dans des cohortes des archives de pathologie du sein Cancer Récupérée forme.
En raison de l’i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 39601006 | Tissue embedding medium, 56 °C melting point |
| Eosin Y 1% water solution | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 510002 | Eosin yellowish, water-soluble |
| Carazzi’s hematoxylin | Bio Optica, Milan, Italy, EU | 506012 | Alum hematoxylin ripened using potassium iodate |
| Diamond quality | Laboindustria, Arzergrande, Italy, EU | 33533 | 26×76 mm microscope slides |
| Leica CV Mount | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | 14046430011 | Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene |
| FLEX IHC microscope slides | Agilent Technologies (Dako), Santa Clara, CA, USA | K8020 | Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC |
| BenchMark ULTRA | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | N750-BMKU-FS | Slide staining system |
| CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4324 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2223 | Primary antibody, ready-to-use |
| CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4286 | Primary antibody, ready-to-use |
| PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary Antibody | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-4493 | Primary antibody, ready-to-use |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-500 | Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies |
| INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4422 | INFORM HER2 Dual ISH assay – Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients |
| ultraView Silver ISH DNP Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-098 | |
| ultraView Red ISH DIG Detection Kit | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 800-505 | |
| ISH Protease 3 | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4149 | Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest |
| Hematoxylin | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2021 | Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent |
| Hematoxylin II Counterstaining | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 790-2208 | Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent |
| Bluing reagent | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 760-2037 | Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides |
| HybReady | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-4409 | Formamide-based buffer for ISH assays |
| EZ Prep (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-102 | Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10. |
| SSC Buffer (10X) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-110 | Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5. |
| ULTRA LCS | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 650-210 | Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-300 | Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-223 | Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use. |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1) | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 950-224 | |
| ultraView Silver Wash II | Ventana medical system, Tucson, AZ, USA | 780-003 | Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps |
| Microtome | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | RM 2255 | Automated rotary microtome |
| Multistainer | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | ST 5020 | Workstation for automated staining and coverslipping |
| Minicore 1 | Alphelys, Plaisir, France, EU | 00-MICO-1 | Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software |
| Aperio ScanScope CS2 | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU | K080254 | Image capture device – digital pathology scanner |
| Tissue-Tek III Uni-Cassette | Sakura Finetek Europe B.V | 4135 | Cassette |
| Tissue-Tek Paraform Standard Base Mold | Sakura Finetek Europe B.V | 7055 | Stainless-Steel base metal mold |
References
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