活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール
Summary
このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング ベースの方法について説明します。
Abstract
T リンパ球は、TCR 活性化の後数分以内に発生する急速な偏波伝達に従事します。これは免疫学のシナプスでは、T 細胞の活性化を調節し、エフェクターの応答を方向ターゲット ステレオタイプ化された細胞の接合部の形成を誘導します。これらのプロセスを効果的に勉強するには、高速、偏光応答をキャプチャに合ったイメージング アプローチが必要です。このプロトコルでは、活性型ペプチド主要組織適合複合体 (pMHC) 紫外線にさらされてまでに非刺激されるに基づいているそのようなシステムについて説明します。正確に TCR 活性化の時空間制御とイメージング内部全反射 (TIRF) によってそれに続く細胞応答の高解像度監視が可能ビデオ顕微鏡の実験中にこの試薬のターゲット decaging。このアプローチはまた遺伝学的および薬理学的摂動戦略と互換性があります。これにより免疫学のシナプスの根底にある偏光の骨格の形成に TCR シグナリング リンク明確の分子経路の組み立てのため。
Introduction
T リンパ球 (T 細胞) 細胞表面 MHC のコンテキストに表示された抗原ペプチドを認識し、細胞性免疫の中心的な役割を再生します。TCR による抗原認識はナイーブ T 細胞の分化をドライブし、エフェクター集団による細胞傷害性とコミュニケーションの応答の配信を促進します。TCR の婚約は、細胞アーキテクチャの劇的な変化を誘導します。分以内に、T 細胞は抗原提示細胞 (APC) の免疫学的シナプス (IS)1,2として知られている偏光インターフェイスを形成側に gloms します。IS は、サイトカインや細胞傷害性 T リンパ球 (Ctl)、溶菌タンパク質 APC を破壊する場合の方向のリリースを有効にするエフェクター T 細胞の反応を増強します。
PMHC TCR 婚約は、最終的に堅牢なシナプス細胞骨格2の改造を促進する活性化 T 細胞 (LAT) のリンカーを含む複数のダウン ストリーム アダプター分子の迅速なリン酸化を誘導します。皮質アクチン フィラメント (アクチン) APC 表面上で広がっている T 細胞をドライブし、F アクチン集積は周縁と中心からの枯渇によって特徴付けられる環状の構造に解決します。F-アクチン リングの形成は微小管組織センター (脂質、T 細胞の中心体とも呼ばれます) の向きかえに密し、インタ フェースのセンターのすぐ下に位置します。両方のイベントは、初期の抗原認識の分内で発生し、それ以降のアクティブ化イベントとエフェクターの応答が発生する建築のコンテキストを確立します。
形成を研究、さまざまな研究機関は、APC は TCR リガンドの固定化を含むかまたはサポート自体が配位子3,4を含む脂質二分子膜ガラス表面で置き換えられますのアプローチを開発しました。T 細胞は、内部全反射蛍光顕微鏡 (TIRF)、共焦点顕微鏡、初期の T 細胞の活性化とは形成の高分解能解析を有効にするイメージを作成することができますこれらの表面上はのような連絡先を形成します。
これらの方法が完全に組み立てられたは優秀な可視化のため許可されていますが、信号の次 TCR:pMHC 結紮の多く発生してから数秒、TCR 活性化を正確に次のイベントのシーケンスを確認する努力を複雑.この問題を回避するために、活性型 pMHC が TCR 活性化5,6、7の時空間的制御を達成するために使用されている、photoactivation アプローチが開発されています。このシステムで T 細胞は TCR 紫外線 (UV) を照射するまでに非刺激は活性型 pMHC を含むガラス表面に添付されます。T 細胞の下にある表面の微小領域における紫外線照射は、T 細胞が認識できる刺激ゾーンを作成する photocage を削除します。その後主セルシグナ リング イベントと細胞骨格改造は、遺伝子にエンコードされた蛍光レポーターを使用してに監視されます。抗原ペプチド、蛾チトクロム c-88 103 (MCC) 及び卵白アルブミン257-264 (OVA) 提示されており、クラスとクラス II MHC-Ekのコンテキストで私 MHC H2 Kb、それぞれ、2 つの活性型バージョンされています。(図 1) を開発しました。これにより、両方の CD4 の解析+ T 細胞 MCC Ek (5 C を表現するために特定C7、2B4、またはと Tcr) および CD8+ T 細胞 (OT1 TCR を表現する) OVA H2 Kbの特定。
初期 TCR シグナリング手順の正確な動態を確立する、また偏光骨格改造5,を支配する分子経路を識別するために過去 10 年間、TCR の photoactivation とイメージングのアプローチに利用されています。6,7,8,9,10です。 たとえば、アッセイはその体を決定する際に尽力した APC に向かって方向転換が中心ですが脂質第 2 メッセンジャー ジアシルグリセロールキナーゼのローカライズされたグラデーションによって媒介されます。この方法論は T 細胞の機能の高解像度イメージング解析が要求される用途に貴重なことを続けることが予想されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
近年では、光は細胞プロセスの時空制御の活性化のための優れたツールとして浮上しています。さまざまな方法論が開発されて、それぞれ関連する利点と欠点を持つ。固定化、細胞外リガンドの decaging に基づいて、ここでは、記載されているシステムは、迅速な細胞内局在、偏光のシグナリング応答の解析に最適です。このアプローチは、上記のように T 細胞では形成を調べるに適用されて…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アドバイスと支援の布施研究室のメンバーに感謝いたします。米国国立衛生研究所 (R01-AI087644 かに)、メモリアル ・ スローン ・ ケタリング癌センターに P30 CA008748 によってサポートされています。
Materials
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermofischer Scientific | 155361 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| EZ-Link NHS-Biotin | Thermofischer Scientific | 20217 | Will need to make Biotinylated Poly-L-Lysine |
| Streptavidin | Thermofischer Scientific | 434301 | |
| BirA-500: BirA biotin-protein ligase standard reaction kit | Avidity | BirA500 | Will be used to biotinylate proteins |
| Biotinylated Hb I-EK | For protein folding, see reference 6. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Biotinylated NPE-MCC I-EK | Anaspec | Custom NPE-MCC (H-ANERADLIAYL-K(Nvoc)-QATK-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated αH2-Kk antibody | BD Biosciences | 553591 | |
| Biotinylated NPE-OVA H2-Kb | Anaspec | Custom NPE-OVA (H-SIINFE-K(Nvoc)-L-OH) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated KAVY H2-Db | Anaspec | Custom synthesized protein (KAVYDFATL) can be purchased from Anaspec | |
| Biotinylated ICAM1 | For protein folding, see reference in protocol. For biotinylation, use BirA kit | ||
| Hand held UV lamp | UVP | UVGL-25 | Lamp is held < 1 cm from the sample. 30 s of 365 light is sufficient for detectable decaging, 20 min for quantitative decaging. |
| Olympus IX-81 OMAC TIRF system. | Olympus | Additional information about the imaging system can be found in Figure 6 | |
| Mosaic digital diaphragm | Andor | ||
| Slidebook software | Intelligent Imaging Innovations |
References
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