Summary

Un Multimodal à l’approche d’imagerie basée sur Micro-CT et Fluorescence moléculaire de positons pour une évaluation longitudinale de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine chez la souris

Published: April 13, 2018
doi:

Summary

Nous décrivons un multimodal non invasive d’imagerie approche basée sur la Micro-CT et fluorescence moléculaire tomographie pour une évaluation longitudinale du modèle souris poumon fibrose induite par instillation intratrachéale double de la bléomycine.

Abstract

La fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie pulmonaire mortelle caractérisée par la destruction progressive et irréversible de l’architecture pulmonaire, ce qui provoque une détérioration significative de la fonction pulmonaire et la mort d’insuffisance respiratoire.

La pathogenèse de l’IPF dans des modèles animaux expérimentaux a été induite par administration de bléomycine. Dans cette étude, nous étudions un modèle de type gif souris induit par une instillation de bléomycine intratrachéale double. Les évaluations histologiques standards utilisées pour l’étude de la fibrose pulmonaire sont invasives terminales. L’objectif de ce travail consiste à surveiller la fibrose pulmonaire grâce à des techniques d’imagerie non invasives comme tomographie moléculaire fluorescente (FMT) et Micro-CT. Ces deux technologies validées avec les conclusions de l’histologie pourraient représenter une approche révolutionnaire fonctionnelle pour suivi non invasif en temps réel de la progression et la sévérité de la maladie du GIF. La fusion des différentes approches représente un peu plus loin pour comprendre la maladie de l’IPF, où les événements moléculaires qui se produisent dans un état pathologique peuvent être observées avec l’ESF et les modifications anatomiques subséquentes peuvent être surveillées par Micro-CT.

Introduction

La fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) est une maladie pulmonaire chronique avec une diminution progressive des fonctions pulmonaires qui est malheureusement souvent fatale dans les quatre ans du diagnostic1. Les principales caractéristiques du CIP sont les dépôts de la matrice extracellulaire et la prolifération des fibroblastes, mais la pathogenèse n’est pas encore pleinement comprise. L’hypothèse la plus soutenue est que plusieurs cycles de lésions pulmonaires provoquent la destruction des cellules épithéliales alvéolaires qui mène à l’altération de la prolifération de cycle de cellules mésenchymateuses, accumulation exagérée des fibroblastes et myofibroblastes, et production accrue de matrice. Médiateurs impliqués dans ces processus, tels que les métalloprotéinases matricielles (MMP) ont été trouvés dysrégulation dans le développement de la fibrose IPF humaine ou dans des modèles animaux induite par la bléomycine. La production de MMP incontrôlée conduit à un dépôt de collagène déséquilibrée dans l’interstitium pulmonaire et de l’espace alvéolaire, imitant la plaie anormale réparation1,2.

L’un des principaux obstacles pour la découverte et le développement est la disponibilité des modèles de souris accessible qui imitent la pathogénèse humaine et le phénotype de la maladie. Des agents différents ont été utilisés pour induire la fibrose pulmonaire chez les modèles animaux : dégâts d’irradiation, l’administration d’amiante et de silice, administration de cytokines fibrinogène et la bléomycine3,4; Cependant la bléomycine est le plus utilisé chez les souris, rats, cobayes, hamsters, lapins5 ou dans les grands animaux (primates non humains, les chevaux, les chiens et les ruminants)6,7. La bléomycine est un antibiotique de la bactérie Streptomyces verticillus8 et est utilisée comme un agent anticancéreux9. La fibrose pulmonaire est un effet secondaire fréquent de la drogue et pour cette raison, il est utilisé dans des modèles animaux expérimentaux pour induire une fibrose pulmonaire.

Dans les modèles de la fibrose pulmonaire induite par la bléomycine, les lésions fibreuses se produisent 14-21 jours après l’administration de la bléomycine. Dans le travail présenté, nous avons utilisé un nouveau protocole pour induire la fibrose du poumon chez les souris par instillation intratrachéale bléomycine double. Le modèle murin de la bléomycine est très chronophage, parce que les nouveaux médicaments doivent être évaluées sur des lésions fibreuses établies et testées pour distinguer leurs effets anti-fibrosants des effets anti-inflammatoires.

Biochimique détermination de la teneur en collagène, morphométriques et analyse histologique étaient fondées sur l’analyse post mortem, limitant la possibilité de suivre la pathogenèse de la maladie chez le même animal. Ces paramètres ont été considérées comme un étalon-or pour l’évaluation de la fibrose, mais ils ne pas fournir toute distribution temporelle ou spatiale de la lésion fibreuse et empêche un moyen d’enquêter sur le processus de progression de la maladie. 10

Récemment, les technologies d’imagerie non invasives ont été appliqués au moniteur transformant des voies respiratoires, l’inflammation et la progression de la fibrose dans les modèles murins : imagerie par résonance magnétique (IRM), tomodensitométrie Micro (Micro-CT), Fluorescence moléculaire Tomographie par ordinateur (FMT) et Bioluminescent (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Nous proposons une approche d’imagerie non invasive pour surveiller la progression de la fibrose pulmonaire par FMT et Micro-CT à différents moments après une bléomycine défi22longitudinalement.

Plusieurs sentiers sont impliqués dans la création et le développement de la fibrose, et pas beaucoup est connu. Seulement une meilleure compréhension de ces processus pourrait se traduire par plusieurs cibles de médicaments qui peuvent céder à l’infirmerie. La possibilité de surveiller longitudinalement activation de MMP par tomographie moléculaire de fluorescence couplée à la détection des changements de parenchyme pulmonaire par Micro-CT peut-être servir à l’avenir à accéder à la réponse clinique au traitement.

Protocol

Toutes les expériences animales décrits ci-après ont été approuvés par le Comité de protection des animaux intra-muros à l’expérimentation animale de Chiesi Farmaceutici et ERASMUS MC sous le numéro de protocole : EMC 3349 (138-14-07) se conformer à l’européen UE Directive 2010/63, Italienne D.Lgs 26/2014 et le révisé de « Guide pour le soin et Use of Laboratory Animals »23. NOTE : Avant toute utilisation, femelles souris C57Bl/6 (7-8 semaines) c…

Representative Results

Résolution spontanée des lésions de fibrose pulmonaire a observé trois semaines après que administration unique de la bléomycine et changements structurels modérés soulignent les limites de ce modèle. Seul un traitement préventif peut être effectué en raison de l’étroite fenêtre thérapeutique qui ne représente pas de pratique clinique17. Ici, nous démontrons que notre protocole d’inst…

Discussion

Malgré les nombreux groupes de recherche se concentrant sur le développement de nouveaux médicaments pour traiter l’IPF, à l’heure actuelle, deux seulement sont disponibles pour les patients. Il y a un besoin médical urgent de trouver des thérapies plus efficaces7 car seul poumon transplantationis capable de prolonger la survie de 4 à 5 ans,26. La préalable indispensable à la médecine translationnelle et développement de nouveaux médicaments est la disponibi…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs aimeraient remercier Dr. Daniela Pompilio et Roberta Ciccimarra pour l’aide technique.

Materials

FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

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Citer Cet Article
Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

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