Tam yerelleştirilmiş ve tekrarlayan aralıklı görüntüleme sırasında beyin dilimler halinde kapalı bir sistemi uzun vadeli kültürü için değiştirilmiş Roller tüp yöntemi
Summary
Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.
Abstract
Kültürlü kemirgen beyin dilimler neurons ve glia birçok normal vivo içinde etkileşimlerinin tutar bir ortamda hücresel ve moleküler davranışını eğitim için yararlı olur. Transgenik fare hatları çeşitli veya viral vektörler kullanımı fluorescently tagged proteinler veya vahşi türü beyin dilimleri gazetecilere ifade için elde edilen dilimleri Floresans mikroskobu ile yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verir. Beyin dilim dilim kültür gerçekleştirme olanağı ile birleştirerek, görüntüleme için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, ancak uzun süreler boyunca canlı dilimleri belirli hücreleri tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sorunlarını yarattığı. Bu en iyi kapalı bir sistem kullanıcıları korumak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için yapılır beri viral vektörler için eksojen proteinlerin ifadesi kullanıldığında bu özellikle doğrudur. Kapalı bir sistemde birçok hafta boyunca dilimleri tekrarlayan yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin basit silindir tüp beyin dilim kültür yöntemine yapılan değişiklikleri rapor edilir. Photoetched coverslips dilimleri kültürü çalışmalarının hızla ve kesin zaman önce ve sonra farklı tedaviler içinde aynı alan görüntü için sahne yeniden konumlandırmak için indirgeme işaretleri kullanımına izin verir. Örnekler, belirli nöronal boyama ve değişiklikleri Hipokampal dilim mimarisinde gözlemlemek için ifade, viral aracılı nöronal deyim floresan proteinlerin ve cofilin patoloji gelişimi ile birlikte bu yöntemin kullanılması için gösterilir, hangi daha önce yanıt olarak amiloid-β (Aβ) peptid reaksiyonlar ile dilim tedavisi Alzheimer hastalığı (Ah) oluşur içinde gözlendi.
Introduction
Birincil kemirgen beyin bölgelerinden Disosiye nöronların uyaranlara yanıt-e doğru hastalık derecesinde gözlemlemek için araştırmacılar tarafından kullanılan önemli bir araç karıştığı kültürdür. Ancak, bu tür çalışmalar nöronlar sadece 2D ve onların gliyal destek sistemi olmadan görüntülemenin dezavantajı var. Ayrıca, içinde hangi o çok yüksek yoğunluklu (640 nöronlar/mm2 veya yüzey alanı yaklaşık % 16) şartları altında yetiştirilen sürece bir dendrite veya axon rasgele akıbet için daha kısa bir mesafe–dan onun hücre gövdesinden Hipokampal takip etmek imkansız hale nöronal canlılık 4 haftadan1yaşa bağlı patolojiler genişletilmiş çalışmaları için Disosiye kültürler kullanımını sınırlama, önemli ölçüde azalır. Kemirgen beyin hazırlanan dilimleri kültür hafta veya ay için bir organize hücre mimarisi ve canlılığı tutarak bu sınırlamalar üstesinden cazip bir seçenektir. Dilim kültür kemirgen beynin birçok farklı bölgeleri korumak için koşullar açıklanan2olmuştur.
İki ana yöntem yaygın beyin dilimleri uzun vadeli kültürü için kullanılan: Hava-sıvı arayüzey3 membranlar üzerinde kültür veya coverslips kapalı tüpler üzerinde kültür izin havalandırma4sağlamak için silindir kuluçka makinesine döndürmek için. Membranlar kültürlü dilimleri bir dik mikroskop ve su daldırma hedefleri5kullanarak yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile doğrudan yansıması. Alternatif olarak, membranlar kültürlü dilimleri dendritik dikenleri bir ters mikroskop6kullanarak iyi çözünürlük elde etmek için cam alt yemekleri transfer edildi. Ancak, her iki yöntem membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri görüntüleme orta herhangi bir değişiklik yapılması ve antifungal ve/veya antibiyotik kirlenme5,6azaltmak veya önlemek için kullandığınız açık sistemlerdir. Mükemmel morfoloji ve hayatta kalma bir membran hava-orta arayüzüne dilimleri korumak, ama deneme sadece küçük hücre grupları takip ediyor sürece yüksek büyütmede tekrarlayan görüntüleme sırasında kesin konumlara dönen son derece zordur Floresan bir işaretleyici ifade ediyorum. Membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri viral aracılı ile ifade transgenes5,6kullanılmıştır, ancak, Biyogüvenlik protokolleri bir kapalı kültür sistemi için kullanılan bazı viral vektörler için istihdam gerekebilir Fluorescently ifade proteinler ve hücre fizyolojisi gazetecilere etiketledi. Ayrıca, daldırma hedefleri dekontaminasyon kültür5‘ te takip edilecektir örnek arasında gerektirir. Bir büyük uygulama membran arabirimi kültürlerin Elektrofizyoloji seferinde Puan7ile yüksek çözünürlüklü görüntülemede birleştiriyor.
Silindir tüp yöntemi ile coverslips plastik tüp içinde herhangi bir Elektrofizyoloji veya yüksek çözünürlüklü görüntü coverslip kaldırmadan izin vermez. Böylece, bu yöntem en sık hangi8sonrası fiksasyon gözlemler yapılmış olan uzun vadeli çalışmalar için uygulanmıştır. Burada açıklanan roller tüp kültür tekniği kullanır ama hkr kültürleri kadar uzun süre yansıması coverslips dilimleri ile delinmiş-out tüplerin üzerinde tutulan bir yöntemdir. Kapalı sistem görüntüleme için orta hiçbir değişiklik gerektirir ve photoetched coverslips günler ya da haftalar, sonra yüksek büyütmede daha önce görüntüsü hassas alanları görüntüleme izin indirgeme işaretleri sağlamak için kullanır.
Kemirgen hipokampüs, hafıza ve öğrenme dahil bir büyük beyin bölgesi değişiklikleri incelemek için bu yöntemi uygulamak. Kemirgen Hipokampus kez kognitif bozukluk9, reklam ortaya gibi gelişimi sırasında gözlenen patolojik veya yaşa bağlı değişiklikler için bir model olarak incelenmiştir. Bizim yöntemi AD8karakteristik olan tek bir dilim içinde Aβ peptidler, artışlar gibi çevresel değişiklikler zamanla geliştirmek patolojik değişiklikleri incelemek için özellikle uygundur. İnsan ve kemirgen reklam beyin ile ilişkili bir patoloji cofilin-aktin toplamları varlığı ve çubuklar, içinde cofilin ve aktin filamentleri ikinci içeren demetleri bir 1:1 molar oranı10,11‘, 12. çubuklar gözlemlenmiştir sabit dilimleri Aβ tedavi aşağıdaki farenin Hipokampus yanı sıra cofilin-GFP hipoksi8‘ e tabi ifade bir canlı kemirgen beyin dilim içinde ve onlar için bir reklam gördüm sinaptik disfonksiyon katkıda bulunabilir ve inme. Burada zaman ders ve dağıtım içinde ifade edilen eksojen chimeric floresan proteinler farklı virüsler tarafından tanıtılan dilim gözlemlemek için bu yeni kodlamayla yöntemi kullanın. Biz o zaman cofilin çubuk ve çözünür Aβ reaksiyonlar (Aβo) ile tedaviye yanıt Hipokampal dilimleri toplama patolojisi gelişimini takip etmek bir cofilin muhabir yapı nöronal belirli ifade kullanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan roller tüp yöntemi uzun vadeli kültür ve dilimlenmiş beyin dokusunun yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme olanağı sağlar. Bir dilim tekniği gibi burada montaj ve bakım dilim olduğunu. Dilim yapışma, destek Coverslip kaplama teşvik neurites akıbet ve hücre dilim dışarı geçiş güçlendirerek dilim inceltme; Böylece, bu yüzeylerde kullanımı kaçınılmalıdır. 3-aminopropyltriethoxysilane ile tedavi kadehte üzerine amino grupları ekleme dilimleri bağlılık gelişm…
Materials
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Bovine | Fisher | 60-516-01KU | 150 units /ml in GBSS/Glucose, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neurosciences. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -. P., Béīque, J. -. C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B., Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer’s disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
