Простой протокол для сверхэкспрессии и очистки оптимизированной кодоном, цис- пренилтрансферазы человека, в неденатурирующих условиях, от Escherichia Coli , а также анализ ферментативной активности. Этот протокол может быть обобщен для производства других цис- prenyltransferase белков в количестве и качестве пригодных для механистических исследований.
Пренилтрансферазы (ПТ) представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) посредством многочисленных реакций конденсации. DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- PT (образующий цис- двойные связи из реакции конденсации), который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP). DHDDS имеет биомедицинское значение, поскольку неконсервативная мутация (K42E) в ферменте приводит к пигментной ретиниту , что в конечном итоге приводит к слепоте. Поэтому настоящий протокол был разработан для получения большого количества очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований. Здесь использовалось использование белкового синтеза, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в <eм> E. Коли. Описанный протокол прост, экономичен и экономит время. Гомология цис- ПТ среди разных видов предполагает, что этот протокол может быть применен и для других эукариотических цис- ПТ, таких как те, которые участвуют в синтезе натурального каучука.
Пренилтрансферазы представляют собой группу ферментов, которые катализируют удлинение цепи аллилдифосфата с использованием изопентенилдифосфата (IPP) с помощью многочисленных реакций конденсации 1 , 2 . Ферменты Z-типа катализируют образование цис- двойных связей из реакции конденсации, тогда как ферменты E-типа катализируют образование транс- двойной связи 3 . Цис- Пренилтрансферазы ( цис- PT, ферменты Z-типа) классифицируются классически по их длине цепи продукта в короткоцепочечные (C 15 ), среднецепочечные (C 50-55 ) и длинноцепочечные (C 70-120 ) 4 . DHDDS (дегидродолихилдифосфатсинтаза) представляет собой эукариотический длинноцепочечный цис- ПТ, который катализирует удлинение цепи фарнезилдифосфата (FPP, аллилдифосфат) через множественные конденсации с изопентенилдифосфатом (IPP) 1, 5 , 6 . Это приводит к образованию дегидродолихилдифосфата, полифенилдифосфата C 55-100, служащего в качестве предшественника доличилпирофосфата, молекулы гликозильного носителя, участвующей в N-связанном гликозилировании белка 1 . Среди ашкеназских евреев миссенс-неконсервативная мутация (K42E) в DHDDS приводит к пигментной аутосомно-рецессивной ретинитации 7 , 8 . Поэтому настоящий протокол был разработан для получения очищенных DHDDS, пригодных для механистических исследований.
Escherichia coli считается наиболее удобным и экономически эффективным хозяином для экспрессии рекомбинантного белка и, следовательно, также является наиболее часто используемым хозяином. Однако, когда вы пытаетесь гетерологично сверхэкспрессировать белки в E.coli , необходимо учитывать специфичные для белка соображения. Получение правильно сложенных, активныхE рекомбинантных белков из E.coli , не является простым делом из-за различий в свойствах различных белков. Для преодоления этих препятствий были разработаны многочисленные подходы. Здесь использовалось использование белка, оптимизированные условия культивирования и оптимизация кодонов, чтобы обеспечить сверхэкспрессию и очистку функционально активных человеческих DHDDS в E. coli . Следует отметить, что предыдущая попытка сверхэкспрессировать дрожжи cis- PT без слияния белка оказалась неудачной из-за полной нерастворимости даже в присутствии детергента 12 . Описанный протокол прост, экономичен, экономит время и позволяет получать препараты DHDDS, подходящие для механистических исследований. Учитывая гомологию цис- ПТ среди разных видов, мы предлагаем, чтобы этот протокол можно было применять и для других эукариотических цис- ПТ.
Протокол, описанный здесь для очистки функциональных человеческих DHDDS в клетках E. coli, прост и эффективен, что позволяет сверхэкспрессировать и очищать белок через 3-4 дня после того, как имеется подходящая конструкция. Такие протоколы для очистки белка имеют особое значение, учитыв…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была профинансирована Центром научно-исследовательского совершенства Израиля (I-CORE) в области структурной клеточной биологии (1775/12), а Научный фонд Израиля предоставил 1721/16 и 2338/16 (YH) и 825/14 (DK ). Поддержка Фонда Fields Estate DK высоко ценится. Эта работа была выполнена Иланом Эдри и Михалом Голденбергом в частичном выполнении требований МД на медицинском факультете Саклера Тель-Авивского университета.
pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |