Summary

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em> Cis</em> -preniltransferase em<em> Escherichia coli</em

Published: August 03, 2017
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Summary

Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.

Abstract

As preniltransferases (PT) são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia do difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação. DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica (formando cis duplas ligações da reação de condensação) que catalisa o alongamento da cadeia do difosfato de farnesilo (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP). DHDDS é de importância biomédica, como uma mutação não-conservadora (K42E) na enzima resulta em retinite pigmentosa , levando finalmente a cegueira. Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir grandes quantidades de DHDDS purificado, adequado para estudos mecanicistas. Aqui, o uso de fusão de proteínas, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humanos funcionalmente ativos em <eM> E. Coli. O protocolo descrito é simples, econômico e economizador de tempo. A homologia de cis -PT entre diferentes espécies sugere que este protocolo pode ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também, como as envolvidas na síntese de borracha natural.

Introduction

As preniltransferases são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia de difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação 1 , 2 . As enzimas de tipo Z catalisam a formação de duplas ligações cis da reação de condensação, enquanto as enzimas do tipo E catalisam a formação de ligações duplas trans 3 . cis -Prenyltransferases (cis-PT, enzimas do tipo Z) são classicamente classificados de acordo com o comprimento da cadeia do produto para de cadeia curta (C 15), de cadeia média (C 50-55), e de cadeia longa (C 70-120 ) 4 . DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica que catalisa o alongamento da cadeia do farnesil difosfato (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP) 15 , 6 . Isto resulta na formação de difosfato de dehidrodolilo, um difosfato de poliprenal C 55-100 que serve como precursor de dolichilpirofosfato, a molécula transportadora de glicosil envolvida na glicosilação de proteína 1 ligada a N. Entre os judeus asquenazes, uma mutação não-conservadora de falta de expressão (K42E) em DHDDS resulta em retinite pigmentosa autossômica recessiva 7 , 8 . Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir DHDDS purificado adequado para estudos mecanicistas.

Escherichia coli é considerada o hospedeiro mais conveniente e econômico para a expressão da proteína recombinante e, portanto, também é o hospedeiro mais utilizado. No entanto, quando se tenta sobreexpressar heterologicamente proteínas em E. coli , devem ser feitas considerações específicas de proteínas. Obtendo corretamente dobrado, ativadoE proteínas recombinantes de E. coli , não é uma questão simples devido às propriedades distintas de diferentes proteínas. Numerosas abordagens foram desenvolvidas para superar esses obstáculos. Aqui, o uso de fusão protéica, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humano funcionalmente ativo em E. coli . De notar, uma tentativa anterior de sobre-expressar levedura cis -PT sem fusão protéica foi infrutífera devido à insolubilidade completa, mesmo na presença de detergente 12 . O protocolo descrito é simples, econômico, economizando tempo e permite a obtenção de preparações DHDDS adequadas para estudos mecanicistas. Dada a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também.

Protocol

1. Clonagem de cis -PT para superexpressão em E. coli Se obter o vector de expressão pET-32b, concebidos para a clonagem e expressão de alto nível de sequências de proteínas fundidas com a proteína de 109aa tioredoxina (TRX) 17, e E. coli cod-optimizada 18 sequcia de comprimento completo -PT-cis codificação. Tome cuidado para ter um site de clivagem de TEV-protease (proteina de vírus de gravura de tabaco) (…

Representative Results

A visão geral da construção usada aqui e o processo de purificação são mostrados na Figura 1 . As amostras obtidas em cada passo de purificação são mostradas na Figura 2 . Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual de DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. A Figura 3 mostra os resultados da SEC analítica da enzima purificada, revelando que a proteína só é obser…

Discussion

O protocolo descrito aqui para a purificação de DHDDS humano funcional em células de E. coli é simples e eficiente, permitindo a sobreexpressão e purificação da proteína em 3 a 4 dias, uma vez que uma construção adequada esteja disponível. Tais protocolos para a purificação de proteínas são de especial importância, dado os avanços no seqüenciamento do genoma, que forneceu uma infinidade de informações sobre a genética de muitas doenças 18 , exigindo assim o desenvol…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo Centro de Excelência em Pesquisa (I-CORE) da Fundação de Ciência da Ciência de Israel (1775/12) e a Fundação de Ciência de Israel concede 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). O apoio da Fields Estate Foundation à DK é altamente apreciado. Este trabalho foi realizado por Ilan Edri e Michal Goldenberg no cumprimento parcial dos requisitos de tese de MD da Faculdade de Medicina de Sackler, Universidade de Tel Aviv.

Materials

pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

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Citer Cet Article
Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).

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