Summary

Um novo uso da ultra-sonografia tridimensional de alta frequência para caracterização de gravidez precoce no Mouse

Published: October 24, 2017
doi:

Summary

Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.

Abstract

Ultra-sonografia de alta frequência (HFUS) é um método comum de forma não-invasiva, monitorar em tempo real desenvolvimento do feto humano no útero. O mouse é usado rotineiramente como um modelo in vivo para estudar a implantação do embrião e progressão da gravidez. Infelizmente, tais estudos murino exigem a interrupção da gravidez para permitir o acompanhamento análise fenotípica. Para resolver esse problema, usamos a reconstrução tridimensional (3D), de HFUS imagens, para a detecção precoce e caracterização de locais de implantação do embrião murino e sua progressão no desenvolvimento individual no utero. Combinando HFUS imagem com reconstrução 3D e modelagem, fomos capazes de precisão quantificar o número de local de implantação de embriões, bem como monitorar a progressão do desenvolvimento em ratos grávidas C57BL6J/129S de 5,5 dias pós coito (d.p.c) através de 9,5 d.p.c com o uso de um transdutor. Medições incluídas: número, localização e volume de locais de implantação, bem como espaçamento inter implantação local; viabilidade do embrião foi avaliada pelo monitoramento da atividade cardíaca. O período pós-implantação imediato (5,5 a 8,5 d.p.c), reconstrução 3D do útero gravid em malha e sobreposição sólida formato habilitado uma representação visual das gravidezes em desenvolvimento dentro de cada corno uterino. Como os ratos geneticamente modificados continuam a ser usados para caracterizar fenótipos reprodutivos femininos, derivados de disfunção uterina, este método oferece uma nova abordagem para detectar, quantificar e caracterizar mais cedo implantação eventos na vivo. Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. Aqui usamos um formato de vídeo e texto para descrever como executar com sucesso ultra-sonografias de gravidez precoce de murino para gerar dados confiáveis e reprodutíveis, com reconstrução da forma uterina em malha e imagens 3D sólidas.

Introduction

Perda de gravidez precoce recorrente é uma das complicações mais comuns após a concepção e afeta aproximadamente 1% dos casais que tentam engravidar1,2. Os mecanismos subjacentes de perda de gravidez precoce são variados: de anormalidades embrionárias intrínsecas e comorbidades maternas para defeitos na receptividade endometrial1,3,4. Por causa de sua rastreabilidade genética, modelos do rato têm sido amplamente utilizados para investigações de implantação do embrião precoce e gravidez. Além disso, o curto tempo gestacional de mouse e a capacidade de realizar estudos em grande escala têm garantido o utilitário crescente do rato em abordar questões-chave clínicos em medicina reprodutiva humana5. Dito isto, a grande maioria dos projetos experimentais murino exige ainda numerosas barragens para ser sacrificado em dias gestacional sequenciais para quantificar e analisar os padrões de espaçamento, número, tamanho e localização do local de implantação durante a gravidez6, 7,8, impedindo, assim, estudos longitudinais do mesmo animal.

Na clínica, o ultra-som é uma ferramenta confiável e de valor inestimável para monitorar viabilidade fetal humana e desenvolvimento em uma forma não-invasiva9,10,11. Mais recentemente, ultra-som de alta frequência (HFUS) começou a encontrar aplicações limitadas no mouse, como um método para monitoramento da viabilidade fetal e crescimento durante gravidez12,13,14. Os recentes avanços tecnológicos em ultra-sonografia permitiram a aplicação de dados (3D) tridimensionais para reconstrução visual de órgãos animais e posterior acompanhamento de patologias15,16, 17. Utilização desta tecnologia de imagem avançada melhorou acentuadamente o poder de detectar flutuações de menor volume, para reduzir a variabilidade de animal para animal e para monitorar a progressão de uma patologia ou a eficácia de uma intervenção terapêutica17. Enquanto o utilitário principal desta tecnologia tem sido monitorar a progressão da malignidade em oncomouse modelos15,16, imagens 3D de HFUS só recentemente tem sido usada para quantificar e monitorar o crescimento ativo de implantação do embrião e desenvolvimento do feto no útero rato18.

Aqui, vamos demonstrar como executar HFUS imagem para produzir dados 2D e 3D para gerar reconstruções do útero rato grávida cedo. Vamos demonstrar a utilidade desse romance método para detectar esses eventos de implantação embrionária precoce sem a necessidade de cessação da gravidez, permitindo que os pesquisadores coletar dados de forma não-invasiva.

Protocol

estes estudos foram conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório publicado pela National Institutes of Health e animais protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Baylor College of Medicine, sob o protocolo número AN-4203. 1. preparação do Mouse grávida para ultra-som Timed acasalamento lugar a represa com um macho fértil comprovada início da noite de rato depois …

Representative Results

Conforme demonstrado na Figura 1, o ultra-som de alta frequência pode detectar a implantação local desenvolvimento começando tão cedo quanto o ponto de tempo 5.5 d.p.c. Usando o isqueiro hiperecoico decidualized endométrio como um marcador de locais de implantação no d.p.c 6.5 permite que o número de locais de implantação e o espaçamento desses sites para ser quantificada. Como a gravidez progride para 7,5 d.p.c, um saco gestacional de mais escuro…

Discussion

Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. No entanto deve notar-se que métodos histológicos ainda seria considerados mais ideais quando caracterização em um nível mais ampliada e mais cel…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos muito a ajuda de Rong Zhao Jie Li e Yan Ying.

Materials

VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine VisualSonics, inc. VS-11945
Vevo Imaging Station VisualSonics, inc. SA-11982
Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel Parker #SKU PLI 01-08
Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle Henry Shein #29404
PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment Dechra #12920060

References

  1. Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
  2. Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
  3. Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
  4. Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
  5. Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
  6. Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
  7. Ding, Y. B., et al. 5-aza-2′-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
  8. Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
  9. Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
  10. Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
  11. Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
  12. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
  13. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
  14. Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
  15. Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
  16. Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
  17. Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
  18. Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
  19. Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for ‘on-time’ embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
  20. Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
  21. Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
  22. Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
  23. Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
  24. Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
  25. Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
  26. Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
  27. Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).

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Citer Cet Article
Peavey, M. C., Reynolds, C. L., Szwarc, M. M., Gibbons, W. E., Valdes, C. T., DeMayo, F. J., Lydon, J. P. A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse. J. Vis. Exp. (128), e56207, doi:10.3791/56207 (2017).

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