Laminin 521 Matrisini Kullanarak İnsan Tarafından Oluşturulan Pluripotent Kök Hücrelerin Entegrasyon Serbest Türevi
Summary
İnsan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam türetilmesi, entegre edilmeyen Sendai virüsü (SeV) vektörü aracılığıyla dermal fibroblastların yeniden programlanması kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HiPS hücre bakımı ve klonal genişleme, rekombinant insan lamınin 521 (LN-521) matrisi ve Esansiyel E8 (E8) Ortamı ile kseno içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak gerçekleştirildi.
Abstract
Xeno içermeyen ve tam olarak tanımlanmış koşullar, homojen insan kaynaklı pluripotent stem (hiPS) hücrelerinin sağlam ve tekrar üretilebilir üretimi için kilit parametrelerdir. Besleyici hücrelerdeki hiPS hücrelerinin bakımı veya tanımlanmamış matrisler, parti varyanslarına, patojenik kontaminasyona ve immünojeniklik riskine duyarlıdır. Tanımlanmış rekombinant insan laminin 521 (LN-521) matrisinin, xeno içermeyen ve tanımlanmış ortam formülasyonları ile kombinasyon halinde kullanılması, değişkenliği azaltır ve hiPS hücrelerinin tutarlı bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Sendai virüsü (SeV) vektörü entegre olmayan RNA tabanlı bir sistemdir, bu nedenle vektörlerin entegre edilebilen genom bütünlüğüne ilişkin potansiyel yıkıcı etkiyle ilişkili endişeleri atlamak. Dahası, bu vektörler dermal fibroblastların yeniden programlanmasında nispeten yüksek verimlilik sergilemiştir. Buna ek olarak, hücrelerin enzimatik tek hücreli pasajlanması, hiPS hücrelerinin homojen bakımını, kök hücre tecrübesine önemli bir deney yapmadan kolaylaştırırKültür yapacağız Burada, çoğaltılabilirlik ve kullanım kolaylığı üzerine yoğun bir şekilde test edilmiş ve geliştirilmiş, fibroblastlardan tanımlanmış ve xeno içermeyen insan hiPS hücreleri oluşturmak için sağlam ve pratik bir yol sağlayacak bir protokolü açıklıyoruz.
Introduction
Takasahi ve diğerleri tarafından hiPS hücre hatlarının ilk türetilmesinden beri 1 , 2 , hiPS hücreleri, hastalıkların modellenmesi, ilaç keşfi ve rejeneratif tıptaki hücre terapileri üretmek için kaynak materyal olarak yararlı bir araç sağlamıştır. HiPS hücre kültürü, uzun süredir fibroblast besleyici hücreler 4 , 5 ile veya Matrigel 6'da ve fetüs sığır serumu (FBS) içeren ortam formülasyonları ile birlikte kültür üzerine bağımlı olmuştur. Toplu iş varyansları, bu kültür koşullarının tanımlanmamış doğasının ortak bir sonucudur ve bu protokollerin güvenirliliğine büyük katkıda bulunan öngörülemeyen varyasyonlarla sonuçlanır 7 . Essential 8 (E8) 8 ve tanımlanmış hücre kültürü matrisleri, örneğin LN-521 9 gibi tanımlanmış ortamın geliştirilmesi,7 , 8 , 9 , 10 homojen hiPS hücrelerinin sağlam üretimi ve bakımında yüksek ölçüde tekrarlanabilir protokollerin kurulması ve yardımına yöneliktir.
Entegrasyonsuz yeniden programlama tekniklerinin geliştirilmesi bir adım öne çıkmıştır. Başlangıçta, yeniden programlama, genom bütünlüğü üzerinde yıkıcı etkilerle rastgele olarak genoma entegre edilmiş retroviral vektörlere dayanmaktadır 11 . Yeniden programlama metodolojilerindeki gelişmeler, RNA'ya dayalı vektörlerin geliştirilmesini içerir. Genomik rekombinasyon yoluyla istenmeyen entegrasyon mümkün olmadığından, RNA vektörlerinin DNA tabanlı yeniden programlama yöntemine göre bir avantajı vardır 12 . SeV vektörleri, bir DNA fazı 11 olmaksızın tek sarmallı RNA aracılığıyla eksojen faktörlerin yüksek ve geçici ekspresyonunu sağlar. SeV tarafından gönderilen yeniden programlama vektörleriHücre genleşmesi boyunca seyreltilir ve nihayetinde yeniden basma işleminin bas baski ücretsiz bir yolu olan kültürden dökülür. Bundan sonra pluripotensin bakımı pluripotens genlerin endojen sentezlenmesine bağlıdır 2 .
Öncü hiPS hücre bazlı tedaviler klinik araştırmalara geçmeye başladıkça, standartlaştırılmış yığınlar, tekrarlanabilirlik ve emniyet talepleri, ele alınması gereken önemli konulardır 13 . Bu nedenle, hayvansal orijinli ürünlerden kaçınılmalıdır. Örneğin, ksenogeneik ürünlerin kullanımı insanlık dışı patojen kontaminasyonu riski ile ilişkilendirilmiştir. Ayrıca, hayvansal kökenli kültür bileşenleri mevcudiyetinde kültürlenen hücrelerin, bağışık olmayan tüy hücreleri meydana getirmek için tehdit eden hücre membranlarında insan dışı sialak asitler içerdiği gösterilmiştir ( 14) . Bu nedenle, gelecekteki tüm klinik araştırmalarda, ksenogeneik ürünleri ortadan kaldırma ihtiyacı gereklidir. Bu protokol xe'yi uygularHiPS hücrelerinin klinik uygunluğa daha yakın hareketli bakımında serbest ve tanımlanmış bir kültür.
Bu protokol, fibroblastlardan standart hiPS hücreleri üreten, tutarlı, yüksek düzeyde çoğaltılabilen ve kullanımı kolay bir yöntemi açıklamaktadır. Ayrıca, kurulu hiPS hücrelerinin bakımı için kullanıcı dostu bir kültür sistemi sunar. Bu protokol, Karolinska Institutet'deki İsveç ulusal insan iPS Çekirdek tesislerinde 300 hiPS'tan daha fazla hücre hattını türetmek için kullanılmıştır; bazı tesislerde bazı hatlar daha önce açıklanmıştır 15 , 16 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolün beklenen sonucu birkaç klonla türetilmiş hiPS hücre hatlarının başarılı bir şekilde üretilmesidir. Önemlisi, burada açıklanan hiPS hücrelerinin bakımı ve genişletilmesi için yöntem güvenilirdir ve kök hücre kültürü için az önceki deneyimle yapılabilir. ROCKi'nin LN-521 matrisiyle birlikte enzimatik tek hücreli geçişi, hücreleri karyotipik olarak normal, pluripotent olarak muhafaza ettiği bilinmektedir ve koloni bazlı geçidin 10 , <…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma SSF (B13-0074) ve VINNOVA (2016-04134) finansman ajanları tarafından desteklendi.
Materials
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | Biopsy digestion |
| Collagenase | Sigma | C0130 | Biopsy digestion |
| Gelatin | Sigma | G1393 | Fibroblast matrix |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast medium |
| PenicillinStreptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Antibiotic |
| Essential 8 media | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS cell culture media |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | iPS cell culture matrix |
| TrypLE select 1X | ThermoFisher Scientific | 12563011 | Dissociation reagent |
| Rho-kinase inhibitor Y27632 | Millipore | SCM075 | Rho-kinase inhibitor (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit | Life Technologies | A1377801 | Sendai virus reprogramming vector |
| 35 mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900.300 | Cell culture |
| 60 mm tissue culture dishes | Sarstedt | 83.3901.300 | Cell culture |
| 24 well tissue culture plates | Sarstedt | 83.3922.300 | Cell culture |
| T25 tissue culture flasks | VWR | 734-2311 | Cell culture |
| 15 ml tubes | Corning | 430791 | Centrifuge tubes |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 0030123.301 | 1.5 ml tube |
| CoolCell cell LX | Biocision | BCS-405 | Freezing container |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | Fibroblast freezing |
| Cryovials 1.8 ml | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryopreservation Kit | Gibco | A2644601 | PSC CryomediumRevitaCell supplement |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisherScientific | 25300054 | Fibroblast dissociation enzyme |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 31331-028 | Digestive enzymes dilutant |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | Biopsy preparation |
| Haemocytometer | Sigma | BRAND, 718920 | Cell counting |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1 (6), 503-509 (2012).
- Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17 (4), 276-280 (2010).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18 (7), 1404-1409 (2003).
- Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
- Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28 (6), 611-615 (2010).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8 (5), 424-429 (2011).
- Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9 (10), 2354-2368 (2014).
- Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
- Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17 (R1), R48-R53 (2008).
- Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11 (2), 228-232 (2005).
- Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17 (3), 474-478 (2016).
- Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
- . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009)
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6 (3), 330-341 (2016).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33 (1), 58-63 (2015).
- . Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016)
- Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15 (1), 254-262 (2015).
