Les auteurs décrivent l’utilisation de laser microdissection de saisie pour prélever des échantillons de populations cellulaires distincts de différentes régions du cerveau pour l’analyse des gènes et des micro-ARN. Cette technique permet l’étude des effets différentiels de traumatisme crânien dans des régions spécifiques du cerveau de rat.
La capacité d’isoler les régions spécifiques du cerveau d’intérêt peut être entravée dans les techniques de dissociation des tissus qui ne conservent pas leur répartition spatiale. Ces techniques d’inclinaison aussi potentiellement analyse d’expression de gène parce que le processus lui-même peut modifier les profils d’expression dans des cellules individuelles. Nous décrivons ici une méthode de microdissection (LCM) de capture de laser pour collecter sélectivement certaines régions du cerveau touchées par traumatisme crânien (TCC) en utilisant une mis à jour le Nissl (violet de crésyle) souillant le protocole et l’orientation d’un atlas de cerveau de rat. LCM donne accès aux régions du cerveau dans leurs positions natives et la possibilité d’utiliser des repères anatomiques pour l’identification de chaque région particulière. À cette fin, LCM a été utilisé précédemment pour examiner l’expression de gènes spécifiques de région de cerveau au TBI. Ce protocole permet l’examen des altérations induites par le TBI dans l’expression de gène et de micro-ARN dans les zones cérébrales distinctes au sein du même animal. Les principes du présent protocole peuvent être modifiés et appliquées à un large éventail d’études qui examinent l’expression du génome aux autres maladie et/ou dans des modèles animaux.
Le cerveau des mammifères est extrêmement complexe et hétérogène avec des centaines de milliers de cellules types1. En effet, études humaines ont montré que dans des régions comme le cortex frontal, structurels et des différences fonctionnelles en matière de blanche et de gris sont consignées dans profils transcriptionnelle distinctes et divergents2. Hétérogénéité de cerveau a été un obstacle majeur pour interpréter les données d’expression génique et dans le domaine de la lésion cérébrale. Cette ambiguïté dans les études précliniques a par la suite mené à des centaines d’essais cliniques ayant échouées de traitements pour des blessures de cerveau3.
Nous utilisons des méthodes de microdissection (LCM) capture laser pour étudier traumatisme crânien (TCC)-induite par la dérégulation du gène dans le rat brain4, en se concentrant sur l’hippocampe, une région du cerveau qui est essentielle pour l’apprentissage et la mémoire5. La capacité de capture au laser et d’analyser l’expression des gènes en mourant et survivant des neurones nous donne une meilleure compréhension du rôle de stochasticité dans l’expression des gènes en déterminant les résultats (la survie neuronale) après TBI6. Techniques de LCM ont également prouvé utiles pour explorer les effets du TBI sur les neurones de l’hippocampe, lorsqu’on compare des jeunes et vieillissement souris rats ou7 8.
Dans des études récentes, nous avons examiné d’autres régions du cerveau de rat défavorablement touchés par TBI, en mettant l’accent sur les domaines chez le rat et chez des patients humains TBI qui sont associées à la fonction exécutive (c.-à-d. le cortex frontal9) et comorbidités TBI ; Ces comorbidités comprennent la dépression (c.-à-d. noyau accumbens10) et des troubles du rythme circadien (de noyau suprachiasmatique11). Dans des études antérieures, Huusko et Pitkanen12 et Drexel et al. 13 utilisé LCM pour étudier l’expression des gènes dans le thalamus et l’hypothalamus. Notre étude s’inspire de ces observations préalables et comprend quatre autres régions du cerveau. Afin d’étudier les changements moléculaires spécifiques à une région induites après TBI, il fallait acquérir de l’expertise dans l’identification et l’obtention des types de cellules dans ces régions à l’aide d’un système de LCM. Les lasers de découpe-UV et infrarouges (IR) permettant de microdissection précise des régions du cerveau désirée. Ici, nous décrivons comment nous utilisons ce système de LCM, guidé par des coordonnées stéréotaxiques dans le rat brain atlas14, afin d’identifier et de capture des quatre régions du cerveau rat qui sont affectées différemment par la méthode de blessures expérimentales fluide-percussion cerveau au laser 4.
Pour les études moléculaires du cerveau chez les mammifères, LCM est devenu une technique essentielle. Cet article montre qu’en utilisant la combinaison de l’IR et UV lasers de découpe dans le système de LCM peut capturer des changements génomiques dans toutes les régions du cerveau chez les mammifères. Ces régions comprennent ceux identifiables avec des colorants de LCM-compatible conventionnels, comme le violet de crésyle ou l’hématoxyline et éosine. La vitesse du processus de laser-capture et capacité d’exécuter LCM sur plus épais 30 µm sections sur des lames de membrane PEN permet d’obtenir non seulement des quantités suffisantes d’échantillons cellulaires, mais aussi pour isoler l’ARN des échantillons de LCM d’une qualité convenable pour tous les types d’aval analyse génomique ; Ces analyses comprennent des microarrays16, PCR les tableaux17et quantitative PCR en temps réel18.
Nos résultats plaident en faveur des études qui utilisent des tissus de LCM. Nous trouvons que miR-15 b est augmentée dans l’hippocampe et le cortex (Figure 4) mais réprimés dans le noyau accumbens et peut être biologiquement pertinente à la compréhension des effets différentiels des TBI dans le cerveau. Une étude antérieure a suggéré qu’une vulnérabilité neuronale corticale au préjudice des augmentations résultent de la surexpression de plusieurs miARN qui régulent négativement les gènes apoptotiques, tels que Bcl-2,19. Objectif scan analyse montre Bcl-2 est également réglementé par miR-15 b ; par conséquent, nos résultats suggèrent une explication mécaniste car pourquoi des régions spécifiques du cerveau (c’est-à-dire, FCx) peuvent être sélectivement vulnérables aux TBI. Il est important de se rappeler la plupart des gènes sont régies par plusieurs miARN et corrélation des changements dans n’importe quel un miRNA à un gène cible spécifique est difficile. En outre, ces données indiquent que certains changements dans l’expression de gène et de micro-ARN peuvent servir de biomarqueurs de lésions cérébrales spécifiques à la région. En effet, nous utilisons actuellement ces données dans les études des neuroprotecteurs comment les nouveaux composés de médicaments ayant des propriétés antidépressives peuvent affecter différemment d’expression de gène et de micro-ARN dans les régions du cerveau liées à des troubles neuropsychiatriques. Une des limites de notre étude est que, durant les nombreuses étapes des procédés de préparation de glissière pour LCM, intégrité de RNA peut devenir compromise. Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour atténuer le risque de dégradation de l’ARN. Une autre limite est la taille de l’échantillon relativement peu utilisée pour les calculs statistiques. À l’avenir des études, augmentation de la taille de l’échantillon devraient diminuer les effets des variations d’expression du gène et miRNA parmi des animaux.
Le bénéfice de LCM est réalisé dans des études de génomique translationnelles à l’aide de modèles animaux de maladies humaines et les tissus malades20,21,22,23. Sans la capacité de capturer des populations de cellules spécifiques, les profils transcriptionnelles de différentes régions du cerveau serait un mélange inconnaissable et indéchiffrable de nombreux types cellulaires. À l’aide de méthodes de LCM dans les études de lésions cérébrales a conduit aux efforts actuels pour délimiter des biomarqueurs spécifiques de cerveau région et comprendre comment ils correspondent aux biomarqueurs du TBI en circulation.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Elizabeth Sumner pour son aide à l’édition de ce manuscrit. Ce projet a été financé en partie par The Moody Project pour translationnelle Traumatic Brain Injury Research and RO1NS052532 de HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |