Describimos el uso del microdissection de la captura del laser para obtener muestras de poblaciones celulares distintas de regiones cerebrales diferentes para el análisis de gen y microRNA. Esta técnica permite el estudio de los efectos diferenciales de la lesión cerebral traumática en regiones específicas del cerebro de rata.
La capacidad de aislar las regiones específicas del cerebro de interés puede ser impedida en técnicas de disociación de tejidos que no conservan su distribución espacial. Estas técnicas también potencialmente sesgan el análisis de expresión génica porque el proceso sí mismo puede alterar los patrones de expresión en células individuales. Aquí describimos un método láser captura de microdisección (LCM) para recoger selectivamente regiones específicas del cerebro afectadas por lesión cerebral traumática (TBI) mediante el uso de un modificado Nissl (cresil violeta) tinción de protocolo y la dirección de un atlas del cerebro de rata. LCM proporciona acceso a las regiones del cerebro en su posición natural y la habilidad de usar puntos anatómicos para la identificación de cada región específica. Con este fin, LCM se ha utilizado anteriormente para examinar la expresión de genes específicos de región cerebro en TBI. Este protocolo permite el examen de las alteraciones inducidas por el TCE en la expresión génica y microRNA en áreas del cerebro distintas dentro del mismo animal. Los principios de este protocolo pueden ser modificados y aplicados a una amplia gama de estudios que examinan la expresión genómica en otras enfermedades o en modelos animales.
El cerebro mamífero es notablemente complejo y heterogéneo con cientos o miles de células tipo1. De hecho, los estudios en humanos han demostrado que en regiones como la corteza frontal, estructurales y las diferencias funcionales en materia blanca y gris se reflejan en perfiles distintos y divergentes transcripcional2. Heterogeneidad de cerebro ha sido un gran obstáculo para interpretar datos de expresión genética y en el campo de la lesión cerebral. Esta ambigüedad en estudios preclínicos ha llevado posteriormente a cientos de ensayos clínicos fallidos de los tratamientos para lesiones de cerebro3.
Utilizamos láser captura de microdisección (LCM) métodos para el estudio de la lesión cerebral traumática (TBI)-inducida dysregulation del gene en la rata cerebro4, centrándose en el hipocampo, una región del cerebro que es esencial para el aprendizaje y la memoria5. La capacidad de captura con láser y análisis de expresión génica tanto en morir como sobrevivir las neuronas nos da una mayor comprensión del papel de la estocasticidad en la expresión génica en la determinación de los resultados (supervivencia neuronal) después de TBI6. Técnicas de LCM también han demostrado ser útiles para explorar los efectos de la TBI en neuronas hipocampales al comparar7 o ratas de ratones jóvenes y el envejecimiento8.
En estudios recientes, se examinaron otras regiones del cerebro de rata impactado por TBI, centrándose en áreas en ratas y en pacientes TBI humanos asociados a la función ejecutiva (es decir, 9de la corteza frontal) y comorbilidades TBI; Estas comorbilidades como depresión (es decir, Núcleo accumbens10) y trastornos del ritmo circadiano (de núcleo supraquiasmático11). En estudios previos, Huusko y Pitkanen12 y Drexel et al. 13 utiliza LCM para examinar la expresión de gene en el tálamo y el hipotálamo. Nuestro estudio se basa en las observaciones anteriores e incluye cuatro otras regiones cerebrales. Para estudiar los cambios moleculares específicos inducidos después de TBI, fue necesario obtener conocimientos en la identificación y obtención de tipos de la célula en estas regiones mediante un sistema de LCM. Los láseres de corte de UV e infrarrojos (IR) permiten la microdisección precisa de regiones cerebrales deseadas. Aquí, describimos cómo utilizamos este sistema LCM, guiado por coordenadas estereotáxicas en el atlas de cerebro de rata de14, para identificar y láser captura cuatro rata regiones del cerebro que son afectadas diferencialmente por el método de lesión experimental cerebro fluido percusión 4.
Para los estudios moleculares del cerebro mamífero, LCM se ha convertido en una técnica esencial. Este artículo demuestra que utilizando la combinación de los láseres de corte de IR y UV en el sistema LCM puede capturar cambios genómicos en cualquier región del cerebro mamífero. Estas regiones incluyen aquellos con manchas de LCM-compatible convencionales, como el violeta de cresilo o hematoxilina y eosina. La velocidad del proceso de captura de láser y capacidad de realizar LCM en secciones gruesas de μm 30 en preparaciones de membrana de pluma permite no sólo obtener suficientes cantidades de muestras de células, sino también para aislar el RNA de muestras de LCM de calidad adecuado para todo tipo de aguas abajo Análisis genómico; Estos análisis incluyen microarrays16, PCR arrays17y cuantitativa PCR en tiempo real18.
Nuestros datos proporcionan un fundamento para los estudios que utilizan tejido de LCM. Nos encontramos con que miR-15b es upregulated en el hipocampo y la corteza (figura 4) o en el Núcleo accumbens y puede ser biológicamente relevante para la comprensión de los efectos diferenciales de la LCT, en el cerebro. Un estudio anterior sugirió que aumentos en la vulnerabilidad neuronal cortical lesiones resultan de sobreexpresión de varios miRNAs que regulan negativamente la pro-supervivencia genes, tales como Bcl-219. Objetivos análisis análisis demuestra Bcl-2 también está regulada por miR-15b; así, nuestros datos sugieren una explicación mecanicista por qué regiones específicas del cerebro (es decir,, FCx) pueden ser selectivamente vulnerables a TBI. Es importante recordar la mayoría de los genes está regulada por varios miRNAs y correlacionar cambios en cualquier uno miRNA a un gene específicos es difícil. Por otra parte, estos datos indican que ciertos cambios en la expresión génica y microRNAs pueden utilizarse como biomarcadores de daño cerebral de cada región. De hecho, actualmente estamos usando estos datos en estudios de neuroprotectores como nuevos compuestos de drogas con propiedades antidepresivo pueden afectar diferencialmente expresión génica y microRNA en regiones del cerebro vinculadas a trastornos neuropsiquiátricos. Una limitación de nuestro estudio es que durante varios pasos de los procesos de preparación de diapositivas para LCM, integridad del RNA puede ser comprometida. Este protocolo describe los pasos necesarios para mitigar el riesgo de degradación de RNA. Otra limitación es el tamaño de muestra relativamente pequeño utilizado para cálculo estadístico. En el futuro estudios, aumento de tamaño de la muestra deben disminuir los efectos de las variaciones de expresión génica y miRNA entre animales individuales.
El beneficio de LCM se realiza en estudios de genómica traslacionales usando los modelos animales de enfermedades humanas y de los tejidos enfermos20,21,22,23. Sin la capacidad de captura de poblaciones celulares específicas, los perfiles transcripcionales de regiones diferentes del cerebro sería una mezcla indescifrable y desconocida de muchos tipos de células. Métodos de LCM en estudios de lesiones de cerebro ha llevado a esfuerzos actuales para delinear biomarcadores específicos de la región de cerebro y entender cómo correlacionan con biomarcadores de TBI que circula.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría reconocer a Elizabeth Sumner ayuda edición de este manuscrito. Financiamiento para este proyecto fue proporcionado en parte por el proyecto de Moody ‘ s para la investigación traslacional de lesión de cerebro traumática y RO1NS052532 a HLH.
Arcturus Laser Capture Microdissection System | Applied Biosystems (Life Technologies) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Arcturus PEN Membrane Glass Slides | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0522 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems (Life Technologies) | LCM0211/LCM0214 | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-Aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB Pharmacy | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Taqman Gene Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | 4331182 | |
Taqman microRNA Expression Primer/Probes | Applied Biosystems (Life Technologies) | A25576 | |
Lightcycler 96 System | Roche |