Summary

Una guía para la producción, cristalización y determinación de la estructura de IKK1/α humano

Published: November 02, 2018
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Summary

IκB cinasa 1/α (CHUK IKK1/α) es una Ser/Thr quinasa que participa en un sinnúmero de actividades celulares principalmente a través de la activación de factores de transcripción NF-κB. Aquí, describimos los principales pasos necesarios para la producción y determinación de estructura cristalina de esta proteína.

Abstract

Una clase de estímulos extracelulares requiere activación de IKK1/α para inducir la generación de una subunidad de NF-κB, p52, por medio del procesamiento de su precursor p100. p52 funciona como un homodímero o un heterodímero con otra subunidad de NF-κB, RelB. Estos dímeros a su vez regulan la expresión de cientos de genes implicados en la inflamación, la supervivencia de la célula y ciclo celular. IKK1/α permanece principalmente asociado con IKK2/β y NEMO como un complejo ternario. Sin embargo, una pequeña piscina de la también se observa como un complex(es) de bajo peso molecular. Se desconoce si la actividad de procesamiento de la p100 es desencadenada por la activación de IKK1/α dentro del más grande o la más pequeña piscina complejo. Actividad constitutiva de IKK1/α se ha detectado en varios tipos de cáncer y enfermedades inflamatorias. Para entender el mecanismo de activación de IKK1/α y permiten su uso como una diana farmacológica, expresamos IKK1/α recombinante en diferentes hosts, como e. coli, insectos y células de mamíferos. Hemos logrado expresar IKK1/α soluble en baculovirus infectan células de los insectos, obtener cantidades de mg de proteína de alta pureza, cristalización en presencia de inhibidores y determinar su estructura de cristal de rayos x. Aquí, describimos los pasos detallados para producir la proteína recombinante, su cristalización y su determinación de estructura cristalina por rayos x.

Introduction

Actividades transcripcionales de la familia del NF-κB de factores de transcripción dimérico son necesarias para diversas funciones celulares que van desde la inflamación y la inmunidad a la supervivencia y muerte. Estas actividades son rigurosamente controladas en las células y una pérdida de regulación conduce a diversas condiciones patológicas, incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer1,2,3. En la ausencia de un estímulo, la actividad de NF-κB se mantiene inhibida de proteínas IκB (inhibidor de – KB)4. La fosforilación de residuos de Ser específicos en proteínas IκB marca por ubiquitinación y degradación proteasomal posterior o procesamiento selectivo5. Dos quinasas Ser/Thr altamente homólogas, IKK2/β y IKK1/α, actúan como reguladores de la central de actividades de NF-κB por llevar a cabo estos eventos de fosforilación6,7.

Interacción entre un ligando y un receptor transmite una señal a través de una serie de mediadores que conducen a la activación de factores NF-κB. El proceso de señalización de NF-κB se puede clasificar ampliamente en dos distintas vías – canónico y no canónico (alternativa)8. La actividad de IKK2/β regula principalmente la señalización de NF-κB de la vía canónica que es esencial para la respuesta inmune inflamatoria y naturales9. Una característica distintiva de esta vía es una activación rápida y de corta duración de IKK2/β10 dentro de un complejo de IKK desacostumbrado hasta entonces bioquímicamente — se presume para ser compuesto de IKK1 IKK2, como un componente regulatorio, NEMO (modulador esencial de NF-κB )11,12,13. Entre las dos subunidades catalíticas de IKK del complejo IKK, IKK2 es sobre todo responsable14 para la fosforilación de los residuos específicos del prototipo IκBs (α, – β y γ-) unido a NF-κB y también una proteína anormal de IκB, NF-κB1/p105, que es un precursor de la de subunidad p50 de NF-κB5. La fosforilación inducida por ubiquitinación y degradación proteasomal de IκB (o procesamiento de p105) conduce a la liberación y activación de un conjunto específico de NF-κB dímeros15. Actividad de NF-κB aberrante debido a función mal regulada de IKK2 se ha observado en muchos tipos de cáncer, así como en trastornos autoinmunitarios2,3,16.

A diferencia de IKK2/β, actividad de IKK1/α regula la señalización de NF-κB de la vía no canónica, que es esencial para el desarrollo y la inmunidad. IKK1 fosforila residuos específicos de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ, que conduce a su transformación y la generación de p52. La formación del heterodímero p52:RelB transcripcionalmente activo inicia una lenta y sostenida ante las señales del desarrollo7,17,18,19,20. Curiosamente, la generación de la central p52 de factor NF-κB de esta vía es críticamente dependiente de otro factor, cinasa de la inducción de NF-κB (NIK)21,22, pero no en IKK2 o NEMO. En las células de reclinación, el NIK sigue siendo bajo debido a su constante degradación dependiente del proteosoma23,24,25. Sobre el estímulo de las células por ligandos ‘no canónico’ y en ciertas células malignas, NIK se convierte estabilizado para reclutar y activar IKK1 / α. actividades quinasa de NIK y IKK1 son esenciales para la transformación eficiente de p100 en p527. IKK1 y NIK fosforilan tres serinas (Ser866, 870 y 872) de NF-κB2/p100 en su segmento terminal C IκBδ a su procesamiento y la generación de p52. Activación aberrante de la vía no canónica se ha implicado en muchas neoplasias como mieloma múltiple26,27,28.

Se conocen varios inhibidores altamente eficientes y específicos de IKK2/β, aunque ninguno hasta ahora han resultado para ser un fármaco efectivo. Por el contrario, los inhibidores específicos de IKK1/α son escasos. Esto puede deberse en parte a la falta de información estructural y bioquímica de IKK1/α, que limita nuestra comprensión de la base mecanicista de la activación de NF-κB por IKK1 en las células y el diseño racional de medicamentos. Las estructuras de rayos x de IKK2/β nos proporcionan penetraciones en el mecanismo de activación de IKK2/β29; sin embargo, estas estructuras no podían revelar cómo los diferentes estímulos arriba activar activación de IKK1/α o β/IKK2 regular conjuntos distintos de NF-κB actividades 30,31. Entender las bases mecanicistas subyacentes a la función de señalización distintiva de IKK1/α y para establecer una plataforma para el diseño racional de medicamentos, nos enfocamos en determinar la estructura de IKK1/α.

Protocol

1. preparación de Virus recombinante adecuado para la expresión a gran escala de IKK1/α Preparación de virus de P1 32 Día 1: Las células Sf9 placa (~ 6 X 105) (paso número menos de 10) en 2 mL de medio de insectos celular de III Sf900 en cada pozo de una placa de 6 pozos e incubar a 27 ° C. Las células de paso al llegar a una densidad de 2 a 3 X 106 células / mL en suspensión diluyendo en medio fresco con una densidad de ~ 6 X 10…

Representative Results

Clonación y expresión de diferentes construcciones de IKK1/αLongitud total que ikk1/α humana fue clonada en el pFastBacHTa de vector de expresión de baculovirus en sus sitios de restricción EcoRI y NotI para obtener un N-terminal hexa-histidina tagged IKK1. La etiqueta podría ser quitada por la digestión de proteasa TEV. Longitud total IKK1/α contiene regiones flexibles en ambos extremos, y regiones flexibles generalmente representar una proteína difícil de…

Discussion

Solución de producción, estructura y cristalización de dos proteínas relacionadas de IKK
Nos propusimos para determinar la estructura de cristal de rayos x de IKK1/α con la idea de que sería un ejercicio relativamente sencillo dado nuestra experiencia con la producción de proteínas, cristalización y determinación estructural de IKK2/β. Sin embargo, nos quedamos muy sorprendidos que estas dos proteínas relacionadas se comportaron muy diferentemente con respecto a la facilidad de cristalizac…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al personal de las líneas 19ID, 24ID y 13ID en avanzada fuente de fotones, Lemont, Illinois, para apoyo en la recopilación de datos sobre varios cristales. Agradecemos a Dmitry Lyumkis, Salk Institute para nosotros obtener el mapa de cryo-EM de baja resolución en las primeras etapas del EM mapa/modelo del edificio, que fue utilizado para construir el modelo inicial de búsqueda de recambio molecular de IKK1. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación de subvenciones de NIH AI064326, CA141722 y GM071862 a GG. SP es actualmente un Wellcome Trust DBT India intermedio.

Materials

Cellfectin/Cellfectin II Thermo Fisher Scientific 10362100 Cellfectin is now discontinued, replaced by Cellfectin II
Sf900 III Insect cell medium Thermo Fisher Scientific 12658-027
SF9 cells Thermo Fisher Scientific 12659017
anti-IKK1 antibody Novus Biologicals NB100-56704 Previously sold by Imgenex
anti-PentaHis antibody Qiagen 34460
PVDF membrane Millipore IPVH00010 Nitrocellulose can also be used
Ni-NTA agarose Qiagen 30210
Bradford assay reagent BioRad 500001
Superdex 200 column GE Healthcare 28989335
Amicon concentrator Millipore UFC801008, UFC803008, UFC201024, UFC203024
Compound A Bayer
Calbiochem IKK-inhibitor XII Calbiochem 401491
Staurosporine SIGMA S4400
MLN120B Millenium Gift item
AMPPNP SIGMA A2647
Dextran sulfate SIGMA 51227, 42867, 31404,
Dextran sulfate Alfa Aesar J62101
PEG SIGMA 93593, 81210, 88276, 95904, 81255, 89510, 92897, 81285, 95172 Some of them are new Cat # on SIGMA catalogue. What we had was originally from Fluka that had different Cat #.
Crystallization Screens
Crystal Screen I and II (Crystal Screen HT) Hampton Research HR2-130
Index HT Hampton Research HR2-134
PEG/Ion and PEG/Ion2 (PEG/Ion HT) Hampton Research HR2-139
PEGRX 1 and PEGRx 2 (PEGRx HT) Hampton Research HR2-086
SaltRx 1 and SaltRx 2 (SaltRx HT) Hampton Research HR2-136
Crystal mounts Hampton Research HR8-188, 190, 192, 194
Synchrotron The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory Beamline 19 ID The Advanced Photon Source (APS) at the U.S. Department of Energy’s Argonne National Laboratory provides ultra-bright, high-energy storage ring-generated X-ray beams for research in almost all scientific disciplines.

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Citer Cet Article
Polley, S., Huang, D., Biswas, T., Ghosh, G. A Guide to Production, Crystallization, and Structure Determination of Human IKK1/α. J. Vis. Exp. (141), e56091, doi:10.3791/56091 (2018).

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