Summary

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Published: August 18, 2017
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Summary

Hier präsentieren wir Protokolle für Waschmittel-freie Homogenisierung der kultivierten Säugerzellen basierend auf Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Diese Methode ist ideal für die Überwachung der Partitionierung von peripheren Membranproteinen zwischen löslich und Membran-Fraktionen.

Abstract

Kultivierte Zellen eignen sich für das Studium der subzellulären Verteilung von Proteinen, einschließlich der peripheren Membranproteine. Genetisch codierte Eindringmittel haben tagged Proteine das Studium der subzellulären Proteinverteilung revolutioniert. Es ist jedoch schwierig zu quantifizieren die Verteilung mit Fluoreszenz-Mikroskopie, vor allem, wenn Proteine teilweise cytosolischen sind. Darüber hinaus ist es oft wichtig, körpereigene Proteine zu studieren. Biochemische Tests wie Immunoblots der Goldstandard für die Quantifizierung der Proteinverteilung nach subzellulären Fraktionierung bleiben. Zwar kommerzielle Kits, die cytosolischen oder bestimmte Fraktionen Membran isolieren wollen, basieren die meisten dieser Kits auf Extraktion mit Reinigungsmitteln, die möglicherweise ungeeignet für das Studium periphere Membranproteine, die leicht aus Membranen extrahiert werden. Hier präsentieren wir ein Waschmittel-freie Protokoll für zelluläre Homogenisierung von Stickstoff Kavitation und nachträgliche Trennung der cytosolischen und Membrane-springen Proteine durch Ultrazentrifugation. Wir bestätigen die Trennung der subzellularen Organellen in lösliche und Pellet Brüche in verschiedenen Zelltypen und Proteingewinnung unter mehrere gemeinsame mechanische Homogenisierung nicht-Reinigungsmittel-basierte Methoden zu vergleichen. Einige Vorteile von Stickstoff ist Kavitation die überlegene Effizienz der zellulären Störungen mit minimalen physikalischen und chemischen Schäden an empfindlichen Organellen. In Kombination mit Ultrazentrifugation Stickstoff Kavitation ist eine hervorragende Methode, die Verschiebung von peripheren Membranproteinen zwischen cytosolischen zu untersuchen und Membran-Fraktionen.

Introduction

Zelluläre Proteine können in zwei Klassen einteilen: diejenigen, die Membranen und diejenigen, die nicht zugeordnet sind. Nicht zugeordneten Membranproteine sind im Zytosol, Nukleoplasma und Lumina von Organellen wie das endoplasmatische Retikulum (ER) gefunden. Es gibt zwei Klassen von Membran-assoziierte Proteine, integralen und peripheren. Integrale Membranproteine sind auch bekannt als transmembrane Proteine, weil ein oder mehrere Segmente der Polypeptid-Kette erstreckt sich über die Membran in der Regel als eine α-Helix bestehend aus hydrophoben Aminosäuren. Transmembrane Proteine sind co-translationally Membranen im Laufe des Jahres ihre Biosynthese eingeschoben und so konfigurierten bleiben, bis sie catabolized sind. Periphere Membranproteine sind sekundär, Membranen, meist als Folge von Post-translationale Modifikation mit hydrophoben Moleküle wie Lipide angetrieben. Im Gegensatz zur integralen Membranproteine die Vereinigung von peripheren Membranproteinen mit Zellmembranen ist reversibel und kann reguliert werden. Viele periphere Membran Proteine funktionieren im Signalwege und geregelte Zusammenarbeit mit Membranen ist ein Mechanismus zum Aktivieren oder hemmen einen Weg. Ein Beispiel für ein Signalmolekül, das eine periphere Membranprotein ist die kleine GTPase, RAS. Nach einer Reihe von post-translationalen Modifikationen, die Änderung mit einem Farnesyl-Lipid enthalten, fügt modifizierte C-Terminus eines ausgereiften RAS-Proteins in der zytoplasmatischen Broschüre von der Zellmembran. Insbesondere ist der Plasmamembran, wo die RAS die nachgeschaltete Effektor RAF1 eingreift. Um konstitutive Aktivierung von Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weg zu verhindern, sind mehrere Ebenen von Kontrolle über RAS. Neben Rendern RAS durch hydrolysieren GTP in BIP inaktiv, können aktive RAS auch von der Plasmamembran durch Modifikationen oder Interaktionen mit Gefäss-Faktoren zur Signalisierung hemmen freigegeben werden. Obwohl fluoreszierende live Imaging Zellbiologen die Möglichkeit bietet, die subzelluläre Lokalisation der fluoreszierende Protein-Tags peripheren Membran Proteine1beobachten, bleibt eine kritische Notwendigkeit auszuwertende Membran Verband der körpereigene Proteine semi-quantitativ mit einfachen biochemischen Ansätzen.

Die richtige biochemische Auswertung der Protein Aufteilung zwischen Membran und löslichen Brüche hängt entscheidend von zwei Faktoren ab: zelluläre Homogenisierung und effiziente Trennung von Membran und löslichen Brüche. Obwohl einige Protokolle, darunter die am weitesten verbreitete kommerzialisierten Kits von Waschmittel-basierte Zelle Homogenisierung abhängen, können diese Methoden Analyse durch die Gewinnung von Membranproteinen in die lösliche Phase2zu verschleiern. Dementsprechend liefern nicht Reinigungsmittel basierte, mechanische Methoden der Zellaufschluss sauberere Ergebnisse. Es gibt mehrere Methoden der mechanischen Störungen der Zellen in Kultur angebaut oder geerntet aus Blut oder Organe. Dazu gehören Dounce Homogenisierung, feinen Nadel Störung, kugelgelagerte Homogenisierung, Beschallung und Stickstoff Kavitation. Wir bewerten hier Stickstoff Kavitation und vergleichen es mit anderen Methoden. Stickstoff-Kavitation stützt sich auf Stickstoff, die in das Zytoplasma der Zellen unter hohem Druck aufgelöst wird. Nach Gleichgewichtherstellung wird die Zellsuspension abrupt auf den atmosphärischen Druck ausgesetzt, so dass Stickstoffluftblasen entstehen im Zytoplasma, die die Zelle als Folge ihrer Aufbrausen aufreißen. Wenn der Druck hoch genug ist, Stickstoff Aufbrausen stören kann der Kern3 und Membran gebunden Organellen wie Lysosomen4. Jedoch wenn der Druck gering genug gehalten wird, unterbrechen die Dekompression die Plasmamembran und ER aber nicht andere Organellen, dabei verschütten Zytosol und intakte zytoplasmatischen Organellen in der Homogenat, der die Cavitate5festgelegt ist. Aus diesem Grund ist Stickstoff Kavitation die Methode der Wahl für die Isolierung von Organellen wie Lysosomen und Mitochondrien.

Es ist jedoch auch eine hervorragende Möglichkeit der Vorbereitung eine homogenisierte, die leicht in Membran und löslichen Brüche unterteilt werden kann. Der Druckbehälter (“the Bomb” bezeichnet) verwendet, während Kavitation besteht aus einem dicken Edelstahl-Gehäuse, die hohen Druck mit einem Einlass für die Lieferung des Gases Stickstoff aus einem Tank und einem Auslass mit einem einstellbaren Auslassventil widersteht.

Stickstoff-Kavitation wurde für Zelle Homogenisierung seit den 1960er Jahren6verwendet. Im Jahr 1961 Jäger und Commerfold7 Stickstoff Kavitation als eine praktikable Option für Säugetier-Gewebe Störung etabliert. Seitdem Forscher haben die Technik, um verschiedene Zellen und Gewebe mit Erfolg angepasst, und Stickstoff Kavitation ist ein Grundnahrungsmittel in mehreren Anwendungen, einschließlich der Membran Vorbereitung8,9, Kerne und Organelle geworden Vorbereitung10,11, und labile biochemischen Abbau. Derzeit beschäftigen Zellbiologen häufiger andere Methoden der Zelle Homogenisierung, weil die Vorteile von Stickstoff Homogenisierung nicht weit ausgeschrieben, Stickstoff-Bomben teuer sind und es ist ein Irrglaube, das ist eine relativ große Anzahl von Zellen Erforderlich. Protokolle für Stickstoff Kavitation, zellfreie Homogenates mit intakten Zellkernen zu erreichen sind nicht veröffentlicht worden, und in die meisten veröffentlichten Bewertungen Volumen von 20 mL Zellsuspension dienten. Um diese klassische Technik aktuelle Anforderungen der Arbeit mit kleinen Proben entsprechend anzupassen, stellen wir einen geänderten Protokoll der Stickstoff Kavitation speziell für kultivierten Zellen. Nach Stickstoff Kavitation, das Homogenat ist getrennt in lösliche (S) und Membran (P) Brüche durch differentielle Zentrifugation, zuerst mit einem Lowspeed Spin, Kerne und ungebrochene Zellen zu entfernen, und dann mit einem High-Speed-Spin (> 100.000 x g) trennen Membranen aus der löslichen Fraktion. Wir analysieren die Effizienz der Trennung mit Immunoblots und Stickstoff Kavitation mit anderen Techniken, mechanische Störungen zu vergleichen. Wir untersuchen auch die osmotische Wirkung der Homogenisierung Puffer während Stickstoff Kavitation.

Protocol

1. Puffer und Ausrüstung Vorbereitungen Chill 45 mL Zelle Störung Bomben, 15 mL-Tuben und Ultrazentrifugation Rohre bei 4 ° c Vorbereiten und chill Homogenisierung Puffer pro 2 x 10 7 Zellen bei 4 ° c hinzufügen eine Protease Inhibitor Tablette kurz vor dem Einsatz 25 mL. Hinweis: Homogenisierung Puffer enthalten in der Regel KCl, anstatt NaCl besser reflektieren intrazellulären Salzzusammensetzung. Homogenisierung Puffer verwendet, die in diesem Protokoll besteht aus 10 mM HE…

Representative Results

Abbildung 2 zeigt die Aufteilung des zellulären Proteinen aus PNS in der löslichen cytosolische Fraktion (S) oder Membran Pellet Bruchteil (P). Wir untersuchten drei repräsentativen Zelllinien aus verschiedenen Zelltypen: HEK-293 (epitheliale), NIH-3 t 3 (Fibroblasten) und Jurkat (Lymphozyten). Rho Guanin Dissoziation Inhibitor (RhoGDI) und kationen-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (CIMPR) dienten als Positivkontrollen für cytosolischen und Membra…

Discussion

Die Vorteile von Stickstoff Kavitation gegenüber anderen Methoden der mechanischen Störungen sind vielfältig. Vielleicht ist der wichtigste Vorteil seine Fähigkeit, sanft aber effizient Proben zu homogenisieren. Die physikalischen Grundlagen der Dekompression kühlt Proben statt erzeugen lokale Erwärmung Schaden wie Ultraschall und Reibung/Scheren Techniken basiert. Kavitation ist auch äußerst effizient in der Plasmamembran zu stören. Da Stickstoff werden Luftblasen innerhalb jeder einzelnen Zelle bei der Dekompr…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von GM055279, CA116034 und CA163489 finanziert.

Materials

Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

References

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Citer Cet Article
Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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