Summary

Fettreiche Ernährung Fütterung und Hochdurchsatz Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster

Published: September 13, 2017
doi:

Summary

Dies ist eine fettreiche Ernährung Fütterung Protokoll zur Fettleibigkeit in Drosophila, ein Modell für Verständnis grundlegende molekulare Mechanismen in Lipotoxicity verwickelt zu induzieren. Es bietet auch einen hohen Durchsatz Triacylglyceride Assay zur Messung der Fettansammlung in Drosophila und möglicherweise andere (Insekt) Modelle unter verschiedenen diätetischen, Umwelt, genetische oder physiologischen Bedingungen.

Abstract

Herzkrankheit ist die häufigste Ursache des menschlichen Todes weltweit. Zahlreiche Studien haben starke Verbindungen zwischen Adipositas und kardiale Störungen beim Menschen gezeigt, aber mehr Instrumente und Forschungsanstrengungen sind erforderlich, die Mechanismen besser aufzuklären. Seit mehr als einem Jahrhundert, das genetisch sehr gefügig Modell von Drosophila maßgeblich an der Entdeckung der Schlüsselgene und molekulare Signalwege, die erwies sich als hoch über Artgrenzen konserviert werden. Viele biologische Prozesse und Krankheitsmechanismen sind funktionell in der Fliege, wie Entwicklung (z.B., Körper Plan, Herz), Krebs und Neurodegenerative Erkrankung erhalten. Vor kurzem spielte das Studium der Fettleibigkeit und sekundären Krankheiten wie Herz-Kreislauferkrankungen in Modellorganismen, eine sehr wichtige Rolle bei der Identifizierung der wichtigsten Regulatoren metabolisches Syndrom beim Menschen beteiligt.

Hier schlagen wir vor, diesem Modellorganismus als ein effizientes Werkzeug zu induzieren, Adipositas, d. h., übermäßige Fettansammlung, und entwickeln ein effizientes Protokoll zur Überwachung der Fettgehalt in Form von TAGs Anhäufung verwenden. Neben den hoch konservierte, aber weniger komplexes Genom hat die Fliege auch eine kurze Lebensdauer für schnelle Experimente, kombiniert mit Wirtschaftlichkeit. Dieser Artikel bietet ein detailliertes Protokoll für hohen Fett-Diät (HFD) Fütterung in Drosophila , Übergewicht und ein hoher Durchsatz Triacylglyceride (TAG) Assay für die Messung der damit verbundenen Zunahme der Fettgehalt, mit dem Ziel, sehr reproduzierbar zu induzieren und effizient für große genetische oder chemische Screening. Diese Protokolle bieten neue Möglichkeiten, um effizient Regulationsmechanismen beteiligt Fettleibigkeit zu untersuchen, sowie bieten eine standardisierte Plattform für Droge-Entdeckung-Forschung für die schnelle Prüfung der Wirkung von Medikamenten-Kandidaten auf die Entwicklung oder Vorbeugung von Fettleibigkeit, Diabetes und metabolische Erkrankungen.

Introduction

Wir befinden uns in einer Zeit, wo Übergewicht und die damit verbundenen wirtschaftlichen Belastungen ist ein weltweites Problem1. Zwei von drei Amerikanern sind übergewichtig oder fettleibig mit den damit verbundenen Herz Krankheiten, die primäre Ursache des Todes in der erwachsenen Bevölkerung2. Neue effiziente Methoden sind notwendig, um die genetischen und molekularen Komponenten beteiligt an der Regulation des metabolischen Syndroms mit Modellorganismen angemessen zu untersuchen. Aus diesem Grund wählen wir die Fruchtfliege Drosophila -Modell, weil es die grundlegende biologische Prozesse mit Säugetieren, einschließlich Menschen und Mäusen3,4,5,6teilt. Drosophila-Genom ist im Laufe der Evolution hoch konservierte aber insgesamt viel kleiner mit weniger Genduplikation und metabolische Komplexität, wodurch es ideal für das Verständnis der grundlegenden Mechanismen in vielen menschlichen Krankheiten4 verwickelt , 7 , 8. auch charakteristische Prozesse durchgeführt durch Fettgewebe, Darm und Bauchspeicheldrüse sind vertreten in der Fliege und vermitteln Regulierungsaufgaben in Glukose und Lipid-Stoffwechsel, zum Beispiel, die ähnlich wie Menschen9, 10,11. Darüber hinaus sind die grundlegende molekulare Wege der Kontrolle von Übergewicht, Insulinresistenz und Diabetes beim Menschen beteiligt in Drosophila Melanogaster12,13,14 funktionell konserviert. , 15 , 16. wie höhere Organismen, Drosophila hat ein schlagendes Herz, die während der Entwicklung durch ähnliche Prozesse der Säugetier-Herz3,17entsteht. So bieten die Entwicklung einer zuverlässigen HFD Fütterung Protokoll und hohem Durchsatz TAG Assay, angepasst für effiziente Sortierung Zwecke mit Hilfe den genetischen Werkzeugkasten von Drosophila, ein wichtiges Mittel zu untersuchen und verstehen die grundlegenden genetische Grundlagen zugrunde liegenden komplexen Stoffwechselerkrankungen.

Das HFD Essen selbst besteht aus einem Standardlabor fliegen Lebensmittel ergänzt mit Kokosnuss-Öl, besteht hauptsächlich aus gesättigten Fettsäuren bekannt, metabolisches Syndrom18zugeordnet werden soll. Während Fettleibigkeit bei Säugetieren Modelle, wie Nagetiere, Induktion Monate19,20nehmen kann, erhöht unsere optimierte HFD Protokoll in Drosophila füttern, effektiv und reproduzierbar organismal Fettgehalt in wenigen Tage12,14. Dieses Protokoll ermöglicht in Verbindung mit einem hohen Durchsatz TAG-Assay, effiziente mass Screening für die Auswirkungen der genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Medikamentenkandidaten neue Modulatoren des Fettstoffwechsels zu entdecken. In der Folge dürften diese Protokolle zu verstehen und/oder Übergewicht und Fettleibigkeit verbundenen menschlichen Krankheiten zu bekämpfen.

Die Fütterung Protokoll ist vielseitig und kann angewendet werden, um die Stoffwechsel- und funktionelle Auswirkungen der einzelnen gesättigte oder ungesättigte Fettsäure zu studieren. Der Einsatz von Hochdurchsatz-TAG Assays beschränkt sich nicht auf D. Melanogaster, sondern kann auf eine Vielzahl von kleinen Modellorganismen mit Kutikula oder harte extrazellulären Matrizen(z. B.andere Drosophila -Arten, C. Elegans angepasst werden und anderen Wirbellosen Modellorganismen) Fettgehalt unter verschiedenen ökologischen, genetischen und physiologischen Bedingungen, in jedem Stadium der Entwicklung, Erwachsenenalter oder Phase Stoffwechselerkrankung zu messen. Die TAG-Assay basiert auf eine farbmetrische Messung aus einer Reihe von enzymatischen Reaktionen, die verschlechtern die TAGs in freie Fettsäuren, Glycerin, Glycerol-3-Phosphat und schließlich H2O2 , das mit 4-Aminoantipyrine (4-AAP) und 3,5 – reagiert Dichlor-2-Hydroxybenzene Sulfonate (3,5 DHBS) eine rote farbige Produkt zu produzieren, die mit einer 96-Well-Spektralphotometer gemessen wird.

Protocol

1. HFD Fütterung Protokoll Tabelle 1. Fliege Nahrungsmittelrezept. Diese Tabelle fasst die verschiedenen Zutaten zur Zubereitung unserer Kontrolle. Sobald gebildet, 10 mL des Essens ist in Fläschchen gegossen, gekühlt und bei 4 ° C für langfristige Lagerung gelagert. HFD Vorbereitung um 1 kg des hohen Fett essen machen, wiegt 700 g vorgefertigte normale fli…

Representative Results

In D. Melanogasterwie der Fall mit anderen Arten ist gibt es Geschlechtsdimorphismus zwischen Männchen und Weibchen22. Es ist bekannt, dass die Weibchen größer, mit mehr Fett in ihre Bäuche als Männchen22 sind. Um die Wirksamkeit unserer Protokoll zu testen, haben wir TAG Tests ermitteln die TAG inhaltliche Unterschiede zwischen Männchen und Weibchen Standardlabor Wildtyp (w1118) fliegt. Die Daten zeigen, d…

Discussion

Adipositas-Induktion bei Mäusen kann Monate19,20nehmen. In Fliegen ermöglicht dieser HFD Fütterung Protokoll für die Induktion von überschüssigen Fettansammlung in einer Angelegenheit von Tagen oder weniger, verursachen erhöht in Fettansammlung erst nach 18 Uhr (siehe Abbildung 2). HFD füttern mit dem beschriebenen Protokoll Glukose Inhalt 12 erhöht oder verringert Bmm Lipase und PGC-1 Ausdru…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchte Erika Taylor für die Bearbeitung dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde finanziert durch Zuschüsse aus der National Institutes of Health (P01 HL098053, P01 AG033561 und R01 HL054732), r.b., doctoral Research Ergänzung (R01 HL085481) und ein Stipendium (AAUW), S.B.D. und Zuschüsse aus der American Heart Association, S.B.D. und R.T.B.

Materials

Talboys Ball dropper/bead Dispenser Talboys #: 930150
Talboys High Throughput Homogenizer Talboys #: 930145
Grinding Balls, Stainless Steel  OPS Diagnostics, LLC # GBSS 156-5000-01 5000 balls
Masterblock 96 Well deep Microplates Greiner Bio-One # T-3058-1 case of 80 plates
Greiner  96 well microplate flat bottom Sigma Aldrich # M4436 40 plates
Greiner CapMat for sealing multiwell plates Sigma Aldrich # C3606 50 sealing plates
Reagent Reservoirs  Thomas Scientific # 1192T71 12/PK
Thermo Scientific Finnpipette 4661040 Thermo Scientific # 4661040 1-10 ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661070 Thermo Scientific # 4661070 30-300ul multipipette
Thermo Scientific Finnpipette 4661020 Thermo Scientific #4661020 10-100ul multipipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3131-S for 10 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc # P3133-S for 200 uL pipette
Multichannel tips Denville Scientific Inc #P1125 for 100 uL pipette
Forceps  Roboz Surgical # 5 Dumonts Super fine forceps
Mettler Toledo Excellence XS Analytical Balance Mfr# XS64 Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-00
Metler Toledo Excellence XS Toploading Balance Cole-Parmer scientific experts # EW-11333-49
96-Well microplate Centrifuge Hettich Zentrifugen # Rotina 420R
Microplate Reader Molecular devices # SpectraMax 190
Lab-Line Bench Top Orbit Environ Shaker Incubator Biostad # 3527
Infinity Triglycerides reagent Thermo Scientific # TR22421
Triglyceride Standard Stanbio #2103 – 030
Quick Start Bradford Protein Assay Bio-RAD # 500-0205 1x dye Reagent
Coconut oil Nutiva # 692752200014 15 0z jar
PBS 10X Thermo Scientific # AM9625 500 ml
Triton X-100 Sigma Aldrich # 9002-93-1
Gas-permeable Foil Macherey-Nagel # 740675 50 pieces
filter Paper VWR # 28317-241 Pack of 100
Drosophila vials Genesee Scientific Cat #: 32-116SB
Quick Start Bovine Serum Albumin Standard Bio-Rad # 5000206
FlyNap Anesthetic Carolina # 173025 100 mL
Kimwipes Low-Lint Uline # S-8115 1-Ply, 4.4 x 8.4"

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Citer Cet Article
Diop, S. B., Birse, R. T., Bodmer, R. High Fat Diet Feeding and High Throughput Triacylglyceride Assay in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (127), e56029, doi:10.3791/56029 (2017).

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