Summary

급성 Hippocampal 조각에 작은 볼륨 재활용-, 관류-침수 형 챔버 시스템 유지에 시 냅 스가 소성을 기록

Published: January 01, 2018
doi:

Summary

이 프로토콜 산소 수준 재활용된 버퍼의 작은 볼륨과 침수 급성 hippocampal 조각 활동 종속 시 냅 스가 소성 녹음의 방법 론 적 측면에서의 안정화를 설명 합니다.

Abstract

비록 뇌 조각에 실험 1951 년부터 사용 되었습니다, 문제는 필드 잠재적인 또는 세포내 녹음을 수행할 때 시 냅 시스 전송의 조음의 안정적이 고 성공적인 분석을 달성의 가능성을 감소 시키는 남아 있다. 이 원고는 상용 침수 챔버에 필드 흥분 성의 postsynaptic 잠재력 기록에 대 한 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 실험 조건 개선에 도움이 될 수 있는 방법론 기능을 설명 합니다. 와 유출 carbogenation 단위. 유출 carbogenation 약물 실험의 비용 효율성을 향상 시키기 위해 작은 버퍼 저수지의 재활용에 의존 하는 실험에서 산소 수준 안정화에 도움이 됩니다. 또한, 원고는 시 냅 시스 전송의 활동-종속 시 냅 스가 소성에 다른 carbogenation 모드와 자극 패러다임의 효과 검사 하는 대표적인 실험을 선물 한다.

Introduction

1951 년에 처음 보고 급성 뇌 조각 실험 실시1했다. Piriform 피2,3 , hippocampal 신경 해 마4, 중 septotemporal 축 transversely 상호는 발견에서 성공적인 생체 외에서 녹음 후 1971 년에는 첫 체 외에 녹음 hippocampal 신경 활동의 달성된5이었다. Vivo에서 그리고 생체 외에서 조건 하에서 뉴런의 신경 생리학 또는 neurostructural 매개 변수의 유사성은 여전히6의 일부 토론 주제 하지만 1975 년에, Schwartzkroin7 표시는 기저 뉴런의 속성은 체 외에서 고 hippocampal 형성에 afferents의 그 높은-주파수 자극 (즉, tetanization)의 시 냅 스 전위8오랫동안 촉진 유도. 신경 활동의 기록 electrophysiological 생체 외에서 크게 확장 활동-종속 시 냅 스가 소성9,10, 블 리스에 의해 1973 년에 발견 했다 세포 메커니즘의 연구 외. 11 vivo에서 토끼로 실험.

신호 경로 뇌 조각, 그리고 급성 hippocampal 조각, 특히 신경 활동의 연구는 이제 표준 도구입니다. 그러나, 의외로, 실험 체 외에 는 아직 표준화 될 준비 및 급성 hippocampal 조각의 유지 보수에 대 한 여전히 존재 하는 여러 방법에 의해 입증. 리드 외. (1988) 12 조각 챔버의 다른 유형과 매체, pH, 온도 및 산소 레벨 목욕의 선택에 급성 뇌 조각의 유지 보수에 대 한 방법론 문제 검토. 이러한 매개 변수는 여전히 조각-녹음 설정 생체 외에서 의 맞춤 요소 때문 녹음 실에서 제어 하기 어렵다. 게시는 설명할 수 있습니다. 극복 하는 데 도움이 방법론 도전과 그의 일부 침수 슬라이스 챔버, 중간 3D microperfusion 시스템13, 향상 된 층 류 및 산소 챔버의 새로운 유형을 찾을 수 있습니다. 14, 컴퓨터 온도 제어15, 시스템 및 다중 챔버 녹음 시스템16공급 한다. 이러한 챔버 구축 하기 쉬운 이므로, 대부분의 과학자 들은 상업적으로 사용 가능한 슬라이스 챔버에 의존 합니다. 이 챔버는 전기 생리학 및 형광 이미징17,,1819의 조합에 대 한 되므로 현미경 시스템에 장착할 수 있습니다. 이 약 실은 뇌 조각 인공 척수 (실제)에 빠져들 계속, 버퍼 솔루션의 높은 유량 필요 유지, 약물 응용 프로그램의 비용을 증가 합니다. 이 위해, 우리는 유출-carbogenation 침수 슬라이스 챔버는 상대적으로 작은 실제 볼륨을 사용 하 여 필드 전위의 장기 기록에 대 한 충분 한 안정성을 제공 하는 재활용 관류 시스템을 통합 했습니다. 또한, 우리는이 실험 carbogenation/관류 시스템의 사용 활동-종속 시 냅 스가 소성10 의 결과 미치는 영향 및 진 핵 신장 요인 2 키 니 아 제 (eEF2K)의 억제 시 냅 스 변조 방법 요약 전송20.

Protocol

동물 동물 보호의 설립된 기준 및 뇌 과학 연구소 및 상태 키 실험실의 의학 신경 생물학의 복 단 대학, 상해, 중국의 절차에 따라 유지 되었다. 1. 솔루션 준비 주: 자료의 테이블을 참조 하십시오. 조각화 버퍼 (수정된 Gey 솔루션) 준비: 92 m m NaCl, 2.5 m m KCl, 1.25 m m NaH2포4, 30 mM NaHCO3, 25 mM 포도 당, 20 mM HEPES, 3mm 나+-pyruvate, 10mm MgSO4</sub…

Representative Results

프로토콜 섹션에서 우리는 조각의 급성 hippocampal hippocampal 형성 (그림 1)의 복 부와 중간 부분에서 남성 C57BL/6 마우스 및 남성 Wistar 쥐 (5-8 주)의 준비를 설명. 슬라이서 플랫폼에 반구의 위치 그들을 안정적으로 유지 하는 데 도움이 하 고 안정화 한 천 또는 agarose의 필요를 제거 합니다. 관류 시스템 자체 운영 하는 액체의 필요한 유량을 주고 높은 회?…

Discussion

인터페이스 슬라이스 챔버 더 강력한 시 냅 스 응답25,26,,2728전시, 침수 챔버 패치 클램프 기록 및 형광에 대 한 추가 편의 제공 이미지입니다. 따라서, 우리 신경17,18, 형광 프로브의 이미지를 쉽게 확장할 수 있는 상업 잠수 슬라이스 챔버를 사용 하 여 ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

트 면 실시, 분석, 실험을 설계 하 고 원고를 썼다. D.X. 및 C.P. 그림 준비에서 원조 하 고 실험을 실시. 이 작품은 NSFC (31320103906)에 의해 지원 되었다 결핵을 111 프로젝트 (B16013)

Materials

Reagents required
NaCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10019318
KCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10016318
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 10017618
MgCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent, China 10012818
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent, China 10005861
NaHCO3 Sinopharm Chemical Reagent, China 10018960
Glucose Sinopharm Chemical Reagent, China 10010518
NaH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20040718
HEPES Sigma H3375
Sodium pyruvate Sigma A4043
MgSO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20025118
NaOH Sinopharm Chemical Reagent, China 10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators Harvard apparatus 55-0012 for rat decapitation
Bandage Scissors SCHREIBER 12-4227 for mouse decapitation
double-edge blade Flying Eagle, China 74-C
IRIS Scissors RWD, China S12003-09
Bone Rongeurs RWD, China S22002-14
Spoon Hammacher  HSN 152-13
dental cement spatula Hammacher  HSN 016-15
dental double end excavator Blacksmith Surgical, USA BS-415-017
Vibrating Microtome Leica, Germany VT1200S
surgical blade  RWD, China S31023-02
surgical holder RWD, China S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller Narishige, Japan PC-10
Vibration isolation table Meirits, Japan ADZ-A0806
submerged type recording chamber Warner Instruments RC-26GLP
thermostatic water bath Zhongcheng Yiqi,China HH-1
4 Axis Micromanipulator Sutter, USA MP-285, MP-225
Platinum Wire World Precision Instruments PTP406
Amplifier Molecular Devices, USA Multiclamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices, USA Digidata 1440A
Anaysis software Molecular Devices, USA Clampex 10.2
Fluorescence Microscope Nikon, Japan FN1
LED light source Lumen Dynamics Group, Canada X-cite 120LED
micropipettes Harvard apparatus GC150TF extracelluar recording
borosilicate micropipettes Sutter, USA BF150-86 patch clamp
tungsten electrode A-M Systems, USA 575500
peristaltic pump Longer, China BT00-300T
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0309 1x inflow, ID: 1.02mm
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0319 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera PCO, Germany pco.edge sCMOS
lens cleaning paper Kodak
50 ml conical centrifuge tube Thermo scientific 339652
Prechamber Warner Instruments BSC-PC
Inline heater Warner Instruments SF-28
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

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Citer Cet Article
Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. J. Vis. Exp. (131), e55936, doi:10.3791/55936 (2018).

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