Summary

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em> Saccharomyces cerevisiae</em

Published: June 03, 2017
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Summary

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Abstract

Genoma de todo el mapa de las interacciones proteína-ADN es fundamental para la comprensión de la regulación de genes, la remodelación de la cromatina, y otros procesos de cromatina-residente. La reticulación del formaldehído seguida por la inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (X-ChIP-seq) se ha utilizado para obtener muchas ideas valiosas sobre la biología del genoma. Sin embargo, X-ChIP-seq tiene limitaciones notables ligadas a reticulación y sonicación. ChIP nativo evita estos inconvenientes omitiendo la reticulación, pero a menudo da como resultado una recuperación deficiente de las proteínas unidas a la cromatina. Además, todos los métodos basados ​​en ChIP están sujetos a consideraciones de calidad de anticuerpos. También se han utilizado métodos enzimáticos para correlacionar interacciones proteína-ADN, que implican la fusión de una proteína de interés con una enzima modificadora de ADN, para mapear interacciones proteína-ADN. Recientemente hemos combinado uno de estos métodos, la cromatina endógena escisión (ChEC), con alto rendimiento de secuenciación como ChEC-seq. ChEC-seq se basa en la fusión de una cromatina-assoc(MNase) para generar segmentación de ADN dirigida en presencia de calcio en células vivas. ChEC-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto eludir las preocupaciones potenciales con la reticulación, sonicación, solubilización de la cromatina, y la calidad de anticuerpos, mientras que la asignación de alta resolución con una mínima señal de fondo. Prevemos que ChEC-seq será una poderosa contrapartida a ChIP, proporcionando un medio independiente para validar los hallazgos de ChIP-seq y descubrir nuevos conocimientos sobre la regulación genómica.

Introduction

El mapeo de los sitios de unión de factores de transcripción (FT), remodeladores de cromatina y otros factores reguladores asociados a la cromatina es clave para comprender todos los procesos basados ​​en la cromatina. Mientras que la inmunoprecipitación de cromatina y la secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) enfoques se han utilizado para obtener muchas ideas importantes en la biología del genoma, tienen limitaciones notables. Recientemente hemos introducido un método alternativo, denominado cromatina endógena clivaje y de alto rendimiento de secuenciación (ChEC-seq) 1 , para eludir estos inconvenientes.

ChIP-seq se realiza más a menudo con un paso inicial de reticulación de formaldehído (X-ChIP-seq) para preservar las interacciones proteína-ADN. Sin embargo, una serie de estudios recientes han indicado que X-ChIP-seq capta transitorios o inespecíficos interacciones proteína-ADN 2 , 3 , 4 , 5 <Sup>, 6 , 7 , 8 , dando lugar a falsos sitios de unión positiva. Además, la sonicación, comúnmente utilizada para fragmentar la cromatina en experimentos X-ChIP-seq, tiende preferentemente las regiones de cromatina abierta, lo que conduce a la recuperación sesgada de los fragmentos de estas regiones [ 9 , 10] . La sonicación también produce una mezcla heterogénea de longitudes de fragmentos, limitando en última instancia la resolución del sitio de unión, aunque la adición de un paso de digestión con exonucleasa puede mejorar en gran medida la resolución 11 , 12 . Los métodos nativos de ChIP tales como regiones ocupadas de genomas de cromatina naturalmente aislada purificada por afinidad (ORGÁNICOS) 13 no usan cromatina de reticulación y fragmentos con nuclease micrococcal (MNasa), aliviando los sesgos potenciales asociados con la reticulación de formaldehído y la sonicación. Sin embargo,La solubilidad de muchas proteínas ligadas a la cromatina en las condiciones relativamente suaves requeridas para la extracción nativa de cromatina es pobre, lo que podría conducir a un rango dinámico reducido y / o falsos negativos [ 14] .

Mientras que varias iteraciones de ChIP-seq son más comúnmente utilizados para el genoma de la cartografía de las interacciones entre proteínas y ADN, varias técnicas de cartografía basada en la fusión de proteínas de interés para diversas enzimas modificadoras del ADN también se han puesto en práctica. Uno de estos enfoques es la identificación de ADN adenina metiltransferasa (DamID) 15 , en el que una proteína de unión a cromatina de interés se fusiona genéticamente con Dam y esta fusión se expresa en células o animales, dando como resultado la metilación de secuencias GATC próximas a los sitios de unión para la proteína. DamID es ventajoso porque no depende de la inmunoprecipitación y evita así la reticulación, los anticuerpos o la solubilización de la cromatina. También se realiza in vivo . sin embargo, La resolución de DamID está limitada a la escala de kilobases y la actividad de metilación de la proteína de fusión Dam es constitutiva. Un segundo método basado en la fusión enzimática es Calling Card-seq 16 , que emplea la fusión de un factor de interés para una transposasa, dirigiendo la integración de transposones específica de sitio. Al igual que DamID, Calling Card-seq no se basa en la inmunoprecipitación y por lo tanto tiene ventajas similares, con el beneficio añadido de una mayor resolución. Sin embargo, Calling Card-seq puede estar limitado por sesgos secuenciales de transposasas y también depende de la presencia de sitios de restricción cercanos a los sitios de inserción del transposón.

Un tercer método de fusión enzimática, desarrollado en el laboratorio de Laemmli, es la cromatina endógena clivaje (ChEC) [ 17] . En ChEC, una fusión entre una proteína asociada a la cromatina y la MNasa se expresa en células, y tras la adición de calcio para activar la MNasa, el ADN se escinde proximalmente a los sitios de unión para la proteína marcada( Figura 1 ). En combinación con Southern blotting, ChEC se ha utilizado para caracterizar la estructura de la cromatina y la proteína vinculante en un número de loci individuales en la levadura 17 , 18 , y se ha combinado con análisis de microarrays de baja resolución para sondar la interacción de componentes de poros nucleares con la levadura Genoma 19 . ChEC ofrece beneficios similares a DamID y Calling Card-seq, y su resolución es casi un par de bases cuando se analiza por la extensión de cebador 19 . ChEC también es controlable: la escisión de ADN robusto por MNasa depende de la adición de calcio milimolar, asegurando que la MNasa es inactiva a las concentraciones de calcio libre bajo observado en las células de levadura vivas [ 20] .

Anteriormente, se postuló que la combinación de ChEC con secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq) proporcionaría mapas de alta resolución de los sitios de unión TF. De hecho, ChEC-seq generaron mapas de alta resolución de los factores reguladores generales (GRFs) Abf1, Rap1 y Reb1 de la levadura en ciernes a través del genoma 1 . También hemos aplicado con éxito ChEC-seq al complejo modular Mediator, un coactivador transcripcional global esencial conservado 21 , ampliando la aplicabilidad de ChEC-seq a complejos de tamaño megadalton que no entran en contacto directo con el ADN y pueden ser difíciles de mapear por ChIP- Basado en los métodos. ChEC-seq es un método poderoso tanto para la validación independiente de los resultados de ChIP-seq como para la generación de nuevos conocimientos sobre la regulación de los procesos residentes en la cromatina. Aquí, presentamos un protocolo paso a paso para la aplicación de este método en la levadura en ciernes.

Protocol

1. Generación de cepas de levadura Genere una cepa de levadura que tenga el factor de interés marcado con MNase. PCR amplifican el casete de marcado MNase del vector deseado ( Tabla 1 ) usando la mezcla de reacción especificada ( Tabla 2 ) y las condiciones de ciclación ( Tabla 3 ). Mezclar 5 μL de la reacción de PCR y 1 μl de colorante de carga de ADN 6X. Ejecutar cada alícuota de PCR en un gel de agarosa al 0,8% a 120 V dur…

Representative Results

En el caso de un experimento de ChEC exitoso, el análisis de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa revelará un aumento dependiente de calcio en la fragmentación del ADN a lo largo del tiempo, tal como se indica por el desprendimiento y la digestión completa final del ADN genómico. En algunos casos, se observa una escalera de bandas similar a la observada con una digestión MNasa tradicional después de una digestión prolongada. Este es el caso de ChEC análisis de Reb1, un …

Discussion

Hemos demostrado que ChEC puede mapear diversas clases de proteínas de levadura en la cromatina, y anticipar que será ampliamente aplicable a diferentes familias de TFs y otros factores de unión a la cromatina en la levadura. ChEC-seq es ventajoso en que no requiere reticulación, solubilización de cromatina, o anticuerpos. Por lo tanto, ChEC evita artefactos potencialmente presentes en X-ChIP-seq, como el artefacto hiper-ChIPable 3 , 4 , y ChIP nativo, tale…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Moustafa Saleh y Jay Tourigny por la lectura crítica del manuscrito y Steven Hahn y Steven Henikoff por su mentoría y apoyo durante el desarrollo de ChEC-seq y su aplicación al complejo Mediator. SG es apoyado por las concesiones de NIH R01GM053451 y R01GM075114 y GEZ es apoyado por fondos de la puesta en marcha de la universidad de Indiana.

Materials

dNTPs NEB N0447
Q5 high-fidelity DNA polymerase NEB M0491L Other high-fidelity DNA polymerases, such as Phusion, may be used for cassette amplification.
TrackIt 1 Kb Plus DNA ladder ThermoFisher Scientific 10488085
Taq DNA polymerase NEB M0273L
cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich 11836170001 It is important that an EDTA-free protease inhibitor mix is used, so as not to inhibit Mnase cleavage by chelation of Ca2+.
PMSF ACROS Organics AC215740010
Digitonin, High Purity EMD Millipore 300410-250MG Make a 2% stock by dissolving 20 mg digitonin in 1 mL DMSO with vigorous vortexing.
Proteinase K, 20 mg/mL Invitrogen 25530049
RNase A, 10 mg/mL ThermoFisher Scientific EN0531
Ampure XP beads Beckman Coulter A63880 Ampure-like beads can be generated using a published protocol (ref 24).
MagneSphere magnetic rack Promega Z5342

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Citer Cet Article
Grünberg, S., Zentner, G. E. Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions with ChEC-seq in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (124), e55836, doi:10.3791/55836 (2017).

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