Summary

Ensaios de caracterização de romance endoteliais reguladores envolvidos na resposta inflamatória de triagem

Published: September 15, 2017
doi:

Summary

Endotélio vascular controla firmemente o recrutamento de leucócitos. Extravasamento de leucócitos inadequado contribui para doenças inflamatórias humanas. Portanto, à procura de novos elementos reguladores de ativação endotelial é necessária projetar terapias melhoradas para desordens inflamatórias. Aqui, descrevemos uma metodologia abrangente para caracterizar o romance reguladores endoteliais que podem modificar leucócitos tráfico durante a inflamação.

Abstract

A camada endotelial é essencial para manter a homeostase do corpo, controlando muitas funções diferentes. Regulação da resposta inflamatória pela camada endotelial é crucial para lutar eficientemente contra entradas prejudiciais e ajuda na recuperação de áreas danificadas. Quando as células endoteliais são expostas a um ambiente inflamatório, tais como o componente exterior da membrana de bactérias Gram-negativas, lipopolissacarídeo (LPS), eles expressam solúveis citocinas pró-inflamatórias, como Ccl5, Cxcl1 e Cxcl10 e acionar o ativação de leucócitos em circulação. Além disso, a expressão de moléculas de adesão E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1 na superfície endotelial permite a interação e a adesão de leucócitos ativados para a camada endotelial e eventualmente o extravasamento para o tecido inflamado. Nesse cenário, a função endotelial deve ser fortemente regulamentada porque ativação excessiva ou com defeito no recrutamento de leucócitos pode levar a desordens inflamatórias-relacionadas. Desde que muitos destes transtornos não têm um tratamento eficaz, novas estratégias com foco na camada vascular devem ser investigadas. Propomos a ensaios abrangentes que são úteis para a busca de novos reguladores endoteliais que modificar a função dos leucócitos. Analisamos a ativação endotelial usando alvos específicos expressão envolvidos no recrutamento de leucócitos (por exemplo, citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão) com várias técnicas, incluindo: (reação em cadeia de polimerase quantitativo em tempo real RT-qPCR), western-blot, ensaios de aderência e citometria de fluxo. Essas abordagens determinar função endotelial no contexto inflamatório e são muito úteis para realizar ensaios de triagem para caracterizar o romance reguladores inflamatórios endoteliais que são potencialmente valiosos para a concepção de novas estratégias terapêuticas.

Introduction

A inflamação é uma resposta biológica benéfica contra agentes infecciosos, com o objectivo principal de eliminar o patógeno e reparar o tecido danificado. Sob certas condições, tais como infecções crônicas ou doenças auto-imunes, inflamação não resolve. Em vez disso, há uma reação anormal com a contínua infiltração de leucócitos, resultando em uma resposta imune prolongada que leva a danos nos tecidos, fibrose, perda de função e em geral, deficiência e em alguma morte de casos do paciente. Estes distúrbios humanos, catalogados como doenças inflamatórias, todos envolvem os vasos sanguíneos para o controle de extravasamento de leucócitos1,2.

As células endoteliais desempenham um papel fundamental na regulação da resposta inflamatória, controlando o tráfico de leucócitos. Quando a camada endotelial é exposta aos mediadores inflamatórios tais como LPS, o endotélio descanso ativa e expressa as citocinas pró-inflamatórias (Cxcl10 Cxcl5, Cxcl1, etc) e moléculas de adesão (E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) esse favor recrutamento de leucócitos para o local de infecção em circulação. Leucócitos aprontados pelas citocinas lançadas depois mediam rolando e interação com a camada endotelial através as contrapartes adesivas correspondentes: PSGL-1 e selectina α4β1 integrina a VCAM-1 e αLβ2 integrina a ICAM-1. Finalmente, os leucócitos migram da vasculatura para o foco da inflamação3.

O papel essencial do endotélio na regulação da resposta inflamatória tem sido demonstrado em ratos que foram geneticamente modificados para expressar o receptor de LPS, receptores do tipo toll 4 (TLR4), apenas sobre as células endoteliais. Estes animais endotelial-TLR4 foram capazes de responder a uma inflamação mediada por LPS e detectar a infecção gerada após a inoculação de bactérias e, consequentemente, alcançar a resolução de infecção e sobrevivência a níveis semelhantes, como o tipo selvagem ratos4 , 5.

Para o caminho de resposta inflamatória endotélio-regulado, foi postulado que a inibição em algumas fases da interação leucócito-endotélio resultaria na redução da migração trans-endotelial e um prognóstico melhor para doenças inflamatórias-relacionados. Na verdade, várias estratégias visando a interação de ativação e leucócito-endotélio endotelial foram projetadas para impedir o extravasamento de células do sistema imunológico como um tratamento para disorders inflammatory6,7.

Neste relatório, descrevemos um grupo completo de técnicas em vitro para caracterizar plenamente a atividade endotelial em resposta para os estímulo inflamatório LPS e seu papel na ativação de leucócitos e adesão à camada vascular. O modelo de célula endotelial usado neste manuscrito foi a linha de endothelial da pilha do pulmão de rato (MLEC-04), conforme descrito por Hortelano et al 8. o MLEC-04 linha de celular foi validada na literatura para ser um sistema adequado para estudar a ativação endotelial9,10. Com base em interesses de pesquisa, essas abordagens podem ser facilmente extrapoladas para qualquer endoteliais ou sistemas de leucócitos e perfil inflamatório. Uma vez que são definidos os parâmetros endoteliais nas condições selecionados, o sistema pode testar novos medicamentos sobre a experimentação proposto para avaliar a ativação vascular. Neste contexto inflamatório, as células do endotélio testadas com o composto de interesse podem ser comparadas com as condições de controle das células, e quaisquer diferenças resultantes podem informar resultado de prognóstico da droga no desenvolvimento e progressão da inflamação. Para concluir, propomos um sistema relevante para caracterizar novos alvos de drogas às células endoteliais, que podem influenciar a concepção de romance vasculares específicas terapias contra doenças inflamatórias relacionadas.

Protocol

1. cultura de células endoteliais cultura de tecido Tratado placas placas de cultura de tecido casaco 100 mm com gelatina de 2,5 mL de solução (autoclavados, 0,1% de gelatina em água destilada) por 30 min a 37 ° C; esse pode ser extrapolada para o formato exigido bem. Aspirar a solução de gelatina e deixe placas para secar ao ar livre do bairro de cultura de tecidos. As condições de cultura de tecido cultivar as MLEC-04 células de…

Representative Results

Avaliação da ativação de células endoteliais induzida por LPS por RT-qPCR As soro fome MLEC-04 células foram estimuladas por 100 ng/mL de LPS para 6h, e a expressão de gene endotelial foi avaliada por meio de RT-qPCR, comparando a expressão de marcadores de ativação para a condição de repouso. Como mostrado na figura 1A, as células de LPS incubados MLEC-04 induziram a expressão de RNAm de…

Discussion

Este protocolo endotelial descreve uma tecnologia gradual que estabelece as bases para explorar novos mecanismos envolvidos na regulação da resposta inflamatória. Essas abordagens baseiam-se no estudo da atividade endotelial estimulado por LPS e avaliar os passos críticos envolvidos no recrutamento de leucócitos durante a resposta inflamatória, especificamente: liberação de citocinas endotelial, adesão endotelial adesão de expressão e leucócitos moléculas para a camada vascular. Uma vez que os parâmetros en…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economía y competitividade (MINECO) e o Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (número de concessão IERPY 1149/16 para A.L.; MPY 1410/09 para S. Hortelano); pelo MINECO através do Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subvenções números PI11.0036 e PI14.0055 para S. Hortelano). S. Herranz foi apoiado por IERPY 1149/16 de ISCIII.

Materials

Gelatin Sigma G9391
DMEM-F12 Lonza BE12-719F
Fetal Bovine Serum Sigma A4503
Penicillin streptomycin Lonza DE17-602E
Trypsine Lonza BE17-160E
EDTA Sigma ED2SS
LPS Sigma L2880
Trizol Sigma T9424 RNA extraction buffer
Isopropanol Sigma 33539
Ethanol absoluto Panreac 1,310,861,612
Pure H2O Qiagen 1017979 RNAse free
Agarose Pronadisa 8020
Stain for agarose gels Invitrogen s33102
SuperScript III First-Strand Synth Invitrogen 18080051 Reagents for RT-PCR
Fast SYBR Green Master Mix Applied Biosystems 4385610 Fluorescent stain for qPCR
MicroAmp Fast Optical 96-Well Applied Biosystems 4346906 Plates for qPCR
U-bottom 96 well plates Falcon 353072
Cytometry tubes Falcon 352054
TX100 Panreac 212314 Non-ionic surfactant
Tris-HCl Panreac 1,319,401,211
Sodium chloride Merck 1,064,041,000
Sodium pyrophosphate Sigma 221368
Sodium fluoride Sigma S7920
Sodium orthovanadate sigma 13721-39-6
Protease inhibitor cocktail sigma P8340
Pierce BCA Protein Assay Kit Pierce 23225 Reagents for bicinchoninic acid assay
β-mercaptoethanol merck 805,740
PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm Thermo Scientific 88518
Tween-20 Panreac 1,623,121,611 Polysorbate 20
PBS Lonza BE17-515Q
ECL Millipore WBKLS0500
Fibronectin Sigma F1141
Laminin Sigma L2020
Collagen type I Sigma c8919
Acetic acid Panreac 1,310,081,611
Trypan blue Sigma T8154
Paraformaldehyde Sigma P6148
Methanol Panreac 1,310,911,612
Crystal violet Sigma HT90132
Sodium citrate Sigma C7254
Ethanol 96% Panreac 1,410,851,212
CFSE Sigma 21888
RPMI Lonza BE12-115F
SDS Bio-Rad 161-0418
Infinite M200 Tecan M200 Multi mode microplate reader
Gel Doc 2000 Bio-Rad 2000 Gel documentation system
StepOnePlus Applied Biosystems StepOnePlus qPCR system
MACSQuant Analyzer 10 Miltenyi Biotec Analyzer 10 Cytometry equipment
ChemiDoc MP Bio-Rad MP Chemiluminescence detection system
Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
PECAM-1 BD Biosciences 553370 Use at 10 µg/ml
ICAM-2 Biolegend 1054602 Use at 10 µg/ml
E-selectin BD Biosciences 553749 Use at 10 µg/ml
VCAM-1 BD Biosciences 553330 Use at 10 µg/ml
ICAM-1 Becton Dickinson 553250 Use at 10 µg/ml
anti-rat IgG-FITC Jackson Immuno Research 112-095-006 Use at 10 µg/ml
anti armenian hamster-FITC Jackson Immuno Research 127-095-160 Use at 10 µg/ml
Rat IgG isotyope control Invitrogen 10700 Use at 10 µg/ml
Armenian hamster IgG isotype control Invitrogen PA5-33220 Use at 10 µg/ml
P-IκΒ-α Cell Signaling 2859 Use at 10 µg/ml
β-Actin Sigma A5441 Use at 10 µg/ml
P-ERK Cell Signaling 9101 Use at 10 µg/ml
anti-mouse HRP GE Healthcare LNXA931/AE Use at 1:10000
anti-rabbit HRP GE Healthcare LNA934V/AG Use at 1:10000
anti-rat HRP Santa Cruz Sc-3823 Use at 1:10000

References

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  2. Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
  3. Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
  4. Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
  5. McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
  6. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
  7. Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
  8. Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
  9. Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
  10. Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
  11. . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
  12. Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  13. . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
  14. He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
  15. . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
  16. Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
  17. Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
  18. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  19. Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
  20. Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
  21. Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
  22. Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
  23. Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).

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Citer Cet Article
Higueras, M. Á., Jiménez-García, L., Herranz, S., Hortelano, S., Luque, A. Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response. J. Vis. Exp. (127), e55824, doi:10.3791/55824 (2017).

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