ניתוח היסטולוגית של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול דג הזברה
Summary
פרוטוקול זה מתאר ניתוח היסטולוגית של הכבד מן הזחלים דג הזברה כי טופלו באתנול 2% עבור 24 שעות. טיפול כזה אתנול חריפה התוצאות סטאטוזיס כבד נפיחות של כלי הדם הכבד.
Abstract
מחלת כבד אלכוהולית (ALD) מתייחסת לנזק לכבד עקב שימוש חריף או חריף באלכוהול. זה בין הגורמים המובילים של תחלואה ותמותה הקשורים אלכוהול, משפיע על יותר מ -2 מיליון אנשים בארצות הברית. הבנה טובה יותר של המנגנונים הסלולר והמולקולריים העומדים מאחורי פגיעה בכבד הנגרמת על ידי אלכוהול היא הכרחית לפיתוח טיפול יעיל ל- ALD. זחלי דג הזברה התערוכה סטאטוזיס כבד ו fibrogenesis רק לאחר 24 שעות של חשיפה לאתנול 2%, מה שהופך אותם שימושי עבור מחקר של פגיעה חריפה בכבד אלכוהול. עבודה זו מתארת את ההליך לטיפול באתנול חריף בזחלי דג הזברה, ומראה כי היא גורמת להתפתחות סטטוזה ונפיחות של כלי הדם הכבד. פרוטוקול מפורט עבור Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים כי הוא מותאם לניתוח היסטולוגית של כבד הזחל דג הזברה, מתואר גם. מכתים H & E יש יתרונות ייחודיים מסוימים על ידי immunofluorescence, כפי שהוא מסמן את כל החייםתאים er ותאים תאיים בו זמנית והוא יכול בקלות לזהות פגיעה בכבד, כגון סטאטוזיס ו פיברוזיס. לאור השימוש הגובר של דג הזברה בדגימת רעלן הנגיף הנגרמת על ידי וירוס, כמו גם מחלות כבד בירושה, פרוטוקול זה משמש כנקודת התייחסות לניתוח היסטולוגית שבוצעה בכל המחקרים הללו.
Introduction
מחלת כבד אלכוהולית (ALD), הנגרמת על ידי צריכת יתר של אלכוהול, היא הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה הקשורים לאלכוהול. בארצות הברית, כמעט מחצית ממקרי המוות של מחלת כבד כרוכים באלכוהול 1 , ו- ALD אחראי על כמעט 1 מתוך 3 השתלות כבד 2 . ALD יש ספקטרום רחב. סטאטוזיס, אשר מאופיין על ידי הצטברות שומנים עודף hepatocytes, מתרחשת בשלב מוקדם של שתייה כבדה והוא הפיך עם הפסקת השימוש באלכוהול. תחת ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים צריכת אלכוהול מתמשך, סטאטוזיס כבד יכול להתקדם הפטיטיס אלכוהוליים, ובסופו של דבר, שחמת הכבד 3 . מחקרים באמצעות מודלים מכרסמים ALD סיפקו תובנות משמעותיות למחלה, אבל יש להם מגבלות (נבדק בהתייחסות 3 ). הזנה אוראלית של דיאטה אלכוהול גורם רק סטאטוזיס במכרסמים 4 , </ Sup> 5 . התפתחות של דלקת ו fibrosis דורש גם העלבון השני 6 , 7 או עירוי intragastric כרונית, אשר פולשנית מבחינה טכנית מאתגר 8 , 9 . דג הזברה Telost גם מפתחת פגיעה בכבד בתגובה לטיפול כרוני ו חריף אלכוהול 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 . בפרט, דג הזברה הזחל מייצג אורגניזם מודל משלים מושך שבו ללמוד פגיעה חריפה בכבד אלכוהול 10 , 11 , 13 , 15 . הכבד דג הזברה הוא פונקציונלי מייצר אנזימים מפתח עבור מטבוליזם אתנול על ידי 4 ימיםשל הפריה (dpf) 13 , 16 , 17. אתנול ניתן להוסיף ישירות למים, וחשיפה לאתנול 2% במשך 24 שעות מספיקה כדי לגרום סטאטוז בכבד ותגובות fibrogenic בזחלים דג הזברה 13 , 15 .
זה כבר דווח כי הטיפול עם אתנול 2% במשך 24 שעות הביאה ריכוז אתנול רקמות של 80 מ"מ זחלים דג הזברה 13 . אחרים הראו כי הזחלים לסבול ריכוז זה פנוטיפים הכבד לראות את החיות המטופלים ספציפיים לחשיפה אתנול 11 , 13 , 15 , 18 . עם זאת, בגלל 80 מ"מ הוא כמעט קטלני בבני אדם 19 , חשוב להעריך את היסטולוגיה הכבד של דג הזברה שטופלו אתנול ו deteRmine הרלוונטיות הפיזיולוגית לבני אדם.
התפתחות חיצונית מהירה שקיפות של הזחלים דג הזברה מאפשרים לאפיין את הפעולה של אלכוהול בתוך הכבד בזמן אמת דגימות קבוע. הזמינות של תאים מסוג ספציפי קווי ניאון מהונדס ההתקדמות האחרונות מיקרוסקופיה confocal להקל על המחקר של כמה סוגים שונים של תאים בכבד לשנות את המורפולוגיה שלהם והתנהגות בתגובה לטיפול אתנול חריפה 11 , 15 . עם זאת, הדמיה confocal של דג הזברה מהונדס פלואורסצנטי לא יכול להחליף לחלוטין Hematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים בעת לימוד היסטולוגיה הכבד. סימון כל סוגי תאי הכבד באותו זמן באמצעות דג הזברה מהונדס דורש את הדור של קווים מהונדס הפרט, כל תיוג אחד סוג תא הכבד עם fluorophore ייחודי. הצגת רקע מהונדס שונה לתוך אותו דג דורש breedinG דורות מרובים, וזה זמן רב ויקר. מכתים immunofluorescence נוספים יש צורך לזהות רכיבים מטריקס תאיים. H & E מכתים, לעומת זאת, בו זמנית תוויות כל סוגי תאי הכבד ורכיבים מטריקס תאיים, ובכך לספק סקירה של הכבד 20 . יתר על כן, הוא מגלה בקלות כמה תכונות histopathological של מחלות כבד, כגון מוות hepatocyte, סטאטוזיס, ו פיברוזיס. למרות H & E הוא כתם שגרתית היסטולוגיה כבד יונקים, זה לא נפוץ במחקר כבד דג הזברה, והפרוטוקול הוא הקים פחות טוב.
עבודה זו מתארת פרוטוקול לטיפול אתנול חריפה הזחלים דג הזברה עבור מעקב אחר היסטולוגית עם מכתים H & E מכתים. פרוטוקול H & E מכתים ניתן להשתמש בכל המחקרים של התפתחות הכבד ואת הפונקציה. יתר על כן, חלקים פרפין יכול לשמש אימונוהיסטוכימיה, כמו גם עבור sta מיוחד אחרIn פתולוגיה של הכבד, כולל כתם trichrome, כתם reticulin, וכו ' .
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך מפורט לטיפול אתנול חריף זחלי דג הזברה ואת ניתוחים histopathological שלאחר מכן עם מכתים H & E. טיפול אתנול חריף צריך להתבצע לא לפני 96 שעות לאחר ההפריה, שכן זהו השלב שבו הכבד דג הזברה מתחיל להביע אנזימים מטבוליזם אלכוהול 13 . 2% אתנול הוא המ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר קייטי מוריי במרכז המשאבים הבינלאומי של דג הזברה; ד"ר סטייסי הופרט וקארי הופרט ב CCHMC, על עצות מועילות שלהם על הפרוטוקול; ו CCHMC שירות וטרינרי, עבור טיפול דגים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R00AA020514 ומענק מחקר מהמרכז לגנום ילדים ב CCHMC (ל- CY). זה היה גם תמיכה בחלקו על ידי מענק NIH P30 DK078392 (אינטגרטיבית מורפולוגיה Core) של מרכז העיכול מחקר מרכז הליבה בסינסינטי.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | E & K Scientific | 280150 | |
| 15 mL conical tubes | VWR International | 89039-664 | |
| 50 mL conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
| 95% ethanol | Decon Labs, Inc. | 2801 | Flammable |
| Acetic acid | Newcomer Supply | 10010A | Irritant |
| Agarose | Research Products International | 9012-36-6 | |
| Aluminum jar rack holder | Newcomer Supply | 5300JRK | |
| Bacteriological petri dishes with lid | Corning | 351029 | |
| Biopsy pads | Simport | M476.1 | |
| Charged slides | Fisher Scientific | 12-550-16 | |
| Clear mounting media | Fisher Scientific | 8310-16 | Can be substituted with other clear mounting media |
| Commercial sea salts | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Disposable microtome blades | Fisher Scientific | 4280L | |
| Dissecting microscope | Leica Biosystems | Leica Mz 95 | |
| Enclosed tissue processor | Leica Biosystems | ASP300 S | |
| Eosin-Phloxine stain set | Newcomer Supply | 1082A | |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Flammable |
| Formaldehyde solution, ACS reagent, 37 WT. % in H20, contains 10-15% methanol as stabilizer (to prevent polymerization) | Sigma-Aldrich | 252549 | A suspected carcinogen; irritant |
| Formalin, Buffered, 10% | Fisher Scientific | SF100-4 | A suspected carcinogen; irritant |
| Graduated media bottle | VWR International | 16159-520 | |
| Harris hematoxylin | Poly Scientific R&D Corp. | s212 | Irritant |
| Histology molds | Sakura Finetek USA Inc | 4557 | |
| Hot plate/Stirrer | VWR International | 47751-148 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144 | Irritant |
| Incubator | VWR International | 97058-220 | |
| Insulin syringes | BD Medical | BD-309301 | |
| Inverted compound microscope | Carl Zeiss Microscopy | 491912-9850-000 | |
| Isopropanol | Newcomer Supply | 12094E | Flammable |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Irritant |
| Microtome | Leica Biosystems | Leica Jung BioCut 2035 | |
| Nutating mixer | VWR International | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | A suspected carcinogen; irritant |
| Pasteur pipet | VWR International | 53283-916 | |
| Pipette pump (10 mL) | VWR International | 53502-233 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Razor blades | Grainger | 4A807 | |
| Slide Staining Kit | Newcomer Supply | 5300KIT | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher BioReagents | S318-500 | Very hazardous |
| Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| Stainless steel strainer (5 inch diameter) | Adaptive Science Tools | L0906045in | |
| Tissue cassettes | Simport | M505.12 | |
| Tissue embedding center | Sakura Finetek USA Inc | #5100 | |
| Tissue wipers, 1-Ply | Fisher Scientific | 06666A | |
| Transfer pipets | Fisher Scientific | 137117M | |
| Tricaine powder/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | Irritant |
| Tris base, primary standard and buffer | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Wash bottle, low-density polyethylene, wide mouth | Nalge Nunc International | 2402-0750 | |
| Xylenes | Fisher Scientific | X3S-4 | Irritant |
References
- Yoon, Y. H., Chen, C. M., Yi, H. Y. . Surveillance report #100: Liver cirrhosis mortality in the United States: National, State, and regional trends. , 2000-2011 (2014).
- Singal, A. K., et al. Evolving frequency and outcomes of liver transplantation based on etiology of liver disease. Transplantation. 95 (5), 755-760 (2013).
- Louvet, A., Mathurin, P. Alcoholic liver disease: mechanisms of injury and targeted treatment. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (4), 231-242 (2015).
- Ki, S. H., et al. Interleukin-22 treatment ameliorates alcoholic liver injury in a murine model of chronic-binge ethanol feeding: role of signal transducer and activator of transcription 3. Hepatology. 52 (4), 1291-1300 (2010).
- Tsuchiya, M., et al. Interstrain differences in liver injury and one-carbon metabolism in alcohol-fed mice. Hepatology. 56 (1), 130-139 (2012).
- Koteish, A., Yang, S., Lin, H., Huang, X., Diehl, A. M. Chronic ethanol exposure potentiates lipopolysaccharide liver injury despite inhibiting Jun N-terminal kinase and caspase 3 activation. J Biol Chem. 277 (15), 13037-13044 (2002).
- Leo, M. A., Lieber, C. S. Hepatic fibrosis after long-term administration of ethanol and moderate vitamin A supplementation in the rat. Hepatology. 3 (1), 1-11 (1983).
- Tsukamoto, H., et al. Severe and progressive steatosis and focal necrosis in rat liver induced by continuous intragastric infusion of ethanol and low fat diet. Hepatology. 5 (2), 224-232 (1985).
- Tsukamoto, H., Mkrtchyan, H., Dynnyk, A. Intragastric ethanol infusion model in rodents. Methods Mol Biol. 447, 33-48 (2008).
- Howarth, D. L., Passeri, M., Sadler, K. C. Drinks like a fish: using zebrafish to understand alcoholic liver disease. Alcohol Clin Exp Res. 35 (5), 826-829 (2011).
- Howarth, D. L., Yin, C., Yeh, K., Sadler, K. C. Defining hepatic dysfunction parameters in two models of fatty liver disease in zebrafish larvae. Zebrafish. 10 (2), 199-210 (2013).
- Lin, J. N., et al. Development of an Animal Model for Alcoholic Liver Disease in Zebrafish. Zebrafish. , (2015).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Tsedensodnom, O., Vacaru, A. M., Howarth, D. L., Yin, C., Sadler, K. C. Ethanol metabolism and oxidative stress are required for unfolded protein response activation and steatosis in zebrafish with alcoholic liver disease. Dis Model Mech. 6 (5), 1213-1226 (2013).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The bHLH transcription factor Hand2 marks hepatic stellate cells in zebrafish: Analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. , (2012).
- Lassen, N., et al. Molecular cloning, baculovirus expression, and tissue distribution of the zebrafish aldehyde dehydrogenase 2. Drug Metab Dispos. 33 (5), 649-656 (2005).
- Reimers, M. J., Hahn, M. E., Tanguay, R. L. Two zebrafish alcohol dehydrogenases share common ancestry with mammalian class I, II, IV, and V alcohol dehydrogenase genes but have distinct functional characteristics. J Biol Chem. 279 (37), 38303-38312 (2004).
- Zhang, C., Ellis, J. L., Yin, C. Inhibition of vascular endothelial growth factor signaling facilitates liver repair from acute ethanol-induced injury in zebrafish. Dis Model Mech. , (2016).
- Vonghia, L., et al. Acute alcohol intoxication. Eur J Intern Med. 19 (8), 561-567 (2008).
- Wittekind, D. Traditional staining for routine diagnostic pathology including the role of tannic acid. 1. Value and limitations of the hematoxylin-eosin stain. Biotech Histochem. 78 (5), 261-270 (2003).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
- Theise, N. D. Histopathology of alcoholic liver disease. Clinical Liver Disease. 2 (2), (2013).
- Lorent, K., et al. Inhibition of Jagged-mediated Notch signaling disrupts zebrafish biliary development and generates multi-organ defects compatible with an Alagille syndrome phenocopy. Development. 131 (22), 5753-5766 (2004).
- Huang, M., Xu, J., Shin, C. H. Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration. J Vis Exp. (111), (2016).
- Paredes, J. F., Lopez-Olmeda, J. F., Martinez, F. J., Sanchez-Vazquez, F. J. Daily rhythms of lipid metabolic gene expression in zebra fish liver: Response to light/dark and feeding cycles. Chronobiol Int. 32 (10), 1438-1448 (2015).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
- van der Velden, Y. U., et al. The serine-threonine kinase LKB1 is essential for survival under energetic stress in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (11), 4358-4363 (2011).
