Summary

Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em> Tribolium castaneum</em> Эмбрионы

Published: April 28, 2017
doi:

Summary

Визуализации морфогенеза эмбрионов насекомых с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией стало состоянием искусства. Этот протокол описывает и сравнивает три монтажных методов , подходящих для Tribolium castaneum эмбрионов, представляет две новые заказные линии трансгенные хорошо подходят для живых изображений, обсуждает основные контроля качества и указывает на существующие экспериментальные ограничения.

Abstract

Красный жук муки Tribolium castaneum стала важной моделью насекомых организма в области генетики развития и эволюционной биологии развития. Наблюдение Tribolium эмбрионов с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными широкопольным и конфокальной флуоресцентной микроскопией. Из-за уникальных свойств светового листа на основе микроскопа, трехмерные изображения живых образцов могут быть записаны с высоким соотношением сигнал-шум и значительно уменьшить фото-отбеливание, а также фото-токсичностью по нескольким направлениям в течение периодов, которые длятся несколько дней. Обладая более чем четырех лет развития методологии и непрерывного увеличение данных, время представляется целесообразным установить стандартные рабочие процедуры для использования светотехники листов в сообществе Tribolium, а также в сообществе насекомых в целом. Этот протокол описывает три крепежных методов, пригодных еили различные цели, представляют два новых заказные трансгенные линии Tribolium подходят для долгосрочного живого изображения, предлагают пять флуоресцентных красители для маркировки внутриклеточных структур фиксированных эмбрионов и предоставляют информацию о данных постобработке для своевременной оценки записанных данных. Представитель результатов сосредоточиться на долгосрочном живом изображении, оптическое секционирование и наблюдении того же эмбрион вдоль нескольких направлений. Соответствующие наборы данных предоставляются в виде загружаемого ресурса. И, наконец, протокол обсуждает контроль качества для анализов живых изображений, существующих ограничений и применимости, указанных процедур к другим видам насекомых.

Этот протокол предназначен прежде всего для биологов развития, которые ищут решение визуализации, превосходящую стандартное лабораторное оборудование. Это способствует непрерывную попытке ликвидировать разрыв между технически ориентированными лабораториями / сообществами, которые разрабатывают и уточняют Microsкопировать методологически, и жизнь научные лаборатории / сообщества, которые требуют решения «подключи и работай» технических проблем. Кроме того, он поддерживает аксиоматический подход, который перемещает биологические вопросы в центре внимания.

Introduction

Красная мука жук Tribolium castaneum, который принадлежит к большому семейству чернотелок (Tenebrionidae), имеет долгую историю в области сельского хозяйства и наук о жизни и является вторым наиболее изученным модель модель насекомое организм после того, как плодовой мушки дрозофилы. В течение последних четырех десятилетий, она стала мощной и популярной моделью насекомых организм в генетике развития, эволюционной биологии развития и, в течение последних двадцати лет, в эмбриональном морфогенезе по целому ряду причин:

Drosophila и Tribolium оба принадлежат к Holometabola, но расходились около 300 миллионов лет назад 1, 2, 3, 4. В то время как эмбриональное развитие дрозофилы обычно считаются весьма производными, Tribolium показывает более наследственный режим Develтие , который найден в значительно большем количестве видов насекомых 5, 6, 7, 8, 9. Во – первых, Tribolium демонстрирует развитие не-инволютированную головы, то есть его ротовые и усики появляются уже в процессе эмбриогенеза 10, 11, 12, 13, 14, 15. Во- вторых, Tribolium следует принципам развития короткого ростка, т.е. брюшные сегменты последовательно добавляют из зоны роста задней во germband удлинением 16, 17, 18, 19. В- третьих, Tribolium развивается и позже деградируетдва внеэмбриональные мембраны , т.е. амнион, который покрывает только эмбрион вентрально, и серозное, который обволакивает эмбрион полностью 20, 21, 22. Обе мембрана играет важные морфогенетическое 23, а также защитную роль в отношении микроорганизмов , 24, 25 и 26 высыхания. В- четвертых, в зародыше развивающиеся ноги полностью работоспособны в течение личиночной стадии жизни и служат зачатков для взрослых ног во время куколки метаморфоза 27, 28, 29, 30, 31.

Из – за их малого размера и скромные требования, выращивание Tribolium в лаборатории довольно просто. Культуры дикого типа (WT) , штаммы или трансгенные линии , как правило , состоит из около 100-300 взрослых и может храниться в течение одного-литровых стеклянных бутылок (80 следа см 2) , заполненные от трех до четырех сантиметров (около 50 г) с ростовой средой, состоящей из полного зерна пшеницы муки с добавлением неактивных сухих дрожжей. Подача воды не требуется. Это позволяет даже небольшие лаборатории, чтобы держать десятки жука культур в пределах малых и средних коммерчески доступных инкубаторах насекомых. Более поздние стадии развития Tribolium (личинки примерно через четвертую возрастную стадию, куколки и взрослые) легко отделяются от ростовой среды путем просеивания. Синхронные эмбрионы получаются путем инкубирования взрослых в течение коротких периодов времени на яйцекладки среды. Для быстрого развития, жук культуры выдерживают при 32 ° C (около четырех недель в поколение), в то время складского учета обычно проводят при температуре 22-25 ° С (около десяти недель на поколение).

В течение последнего десятилетия, многие стандартные ТЕСhniques постепенно адаптированы и оптимизированы для Tribolium, как представлено в книгах Emerging модельных организмов 32. Большое значение имеют расширенный генетические методы , такие как эмбриональное 33, личиночной 34, 35 или родительская 36, 37 РНК – интерференции на основе гена нокдаун, зародышевой преобразование либо с PiggyBac 38, 39 или система транспозаза Минос 40 и CRISPR / геном cas9 на основе инжиниринг 41. Кроме того, Tribolium геном был секвенирован около десяти лет назад 42, и в настоящее время в третьем раунде генома узла выпуска 43, что позволяет эффективно и геном идентификации и систематический анализ генов 44 </sвверх> или другие генетические элементы 45, 46. Кроме того, геном четырех других видов жесткокрылых доступны для сравнительных генетических подходов 47, 48, 49, 50. В ассоциации с виртуализированным геномом, два крупномасштабных генетические анализы были выполнены, т.е. инсерционного мутагенеза экрана 51 и гена нокдаун экрана 52, 53 Систематическое РНК – интерференция основы.

Флуоресцентный живой визуализации с широкопольных, конфокальной или легкого листа на основе микроскопии (LSFM) позволяет наблюдать эмбриональных морфологии Tribolium как функцию времени (т.е. морфогенез) в многомерном контексте (таблица 1). В широкопольными и конфокальной флуоресцентной микроскопии excitция и излучение света направляется через ту же самую линзу объектива. В обоих подходах весь образец освещается для каждого записываемого двухмерной плоскости. Таким образом, образцы подвергают очень высокий уровень энергии. В LSFM, только флуорофоры в фокальной плоскости возбуждаются за счет расцепления освещения и обнаружения с помощью двух перпендикулярно расположенных линз объектива (фиг.1). LSFM поставляется в двух канонические реализаций – единственная плоскость освещения микроскопа (SPIM) и цифровой сканируется лазерный луч листа на основе флуоресцентного микроскопа (DSLM, рисунок 2) – и предлагает несколько важных преимуществ по сравнению с традиционными подходами: (я) внутренняя способность оптического секционирования, (II) хорошее осевое разрешение, (III) сильно сниженный уровень фото-отбеливания, (IV) очень низкая фото-токсичность, (v) высокое отношение сигнал-шум, (VI) относительно высокая скорость сбора данных, (VII) формирования изображения по нескольким направлениям и (VIб) более глубокое проникновение ткани за счет использования низкой освещенности числовая апертура линзы объектива 54, 55, 56.

LSFM уже успешно применяется в Tribolium к документу почти весь эмбриональный морфогенеза 57 и проанализировать принципы внеэмбрионального разрыва мембраны в начале закрытия дорсальных 23. Для того, чтобы повысить привлекательность LSFM в сообществе Tribolium и для науки насекомых в целом, это имеет большое значение для установления стандартных рабочих процедур и совершенствование методов, протоколов и пула ресурсов до уровня , где микроскоп становится простотой -Использование стандартного инструмента в развитии биологии лабораторий, а также биологические вопросы остаются в центре внимания.

Этот протокол начинается с основами Tribolium </ EM> выращивание, т.е. содержание, размножение и сбор эмбрионов. Далее, две экспериментальные стратегии проиллюстрированы: (я) живая визуализация заказных линий трансгенных и (б) формирования изображения фиксированных эмбрионов , которые были окрашенными флуоресцентными красителями (Таблица 2). Впоследствии три монтажные методы с несколько различными целями подробно описаны (рис 3 и таблицей 3): (я) агарозный колонок, (II) агарозное полушарие и (III) роман держатель паутины. Протокол затем объясняет процедуру сбора данных с LSFM. методы визуализации и ключевые соображения изложены. И, наконец, извлечение эмбриона объясняется и предложения для основной обработки данных предоставляются. В репрезентативных результатов, живые данные изображений из двух новых на заказ и глии-голубые 58 трансгенные линии показаны и соответствующие наборы данных изображений представлены в виде загружаемого ресурса. Кроме того, изображениеДанные фиксированных эмбрионов, которые были окрашены с различными флуоресцентными красителями представлены. Обсуждение фокусируется на контроле качества, существующих ограничения подхода живого изображения и адаптацию протокола к другим видам.

Протокол написан для легких листовых на основе флуоресцентных микроскопов, которые оснащены отборную камеру и с возможностью вращения механизма зажима для стандартных держателей образцов 54, 59, 60, которые , как правило цилиндрической формы элементы , изготовленные из металла, пластика или стекла с диаметром в миллиметровом диапазоне. Протокол также подходит для обоих канонические реализаций, т.е. SPIM и DSLM, а также для установок с двумя или более освещения и обнаружения оружия 61, 62, 63. Представительные результаты показывают данные в двух спектральных каналах, зеленый (ILLumination с 488 нм лазера, обнаружение с помощью 525/50 полосовой фильтр) и красный (освещение с 561 нм лазера, обнаружение через 607/70 полосовой фильтр), но протокол может быть расширена до трех или четырех спектральных каналов.

Protocol

1. Земледелие из Tribolium культур Примечание: Стандартные условия определяются как при температуре инкубации 25 ° С и 70% относительной влажности в течение 12 ч светлых / 12 ч темнота. Для получения более подробной информации о Tribolium хозяйства, соответствующие рекоменда?…

Representative Results

Этот протокол описывает экспериментальную основу для флуоресцентной визуализации живых или фиксированных и окрашенных эмбрионов Tribolium с LSFM. Из-за низкие уровни фото-отбеливание и фото-токсичность, является прямым следствием его способности оптического секцион…

Discussion

Контроль качества

В анализах живых изображений, процедура подготовки и записей должна быть неинвазивной, то есть ни механический и обработки химических (сбор, dechorionation, монтаж на держатель образца) , ни интегрированной энергетической нагрузку во время набл…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Свен Плата за техническую поддержку. Глия-голубой трансгенная линия была своего рода подарок от Грегор Бачер (Геттинген, Германия). Исследование финансировалось Скопление Превосходство Франкфурт-на-Майне для макромолекулярных комплексов (CEF-MC, EXC 115, динамик Фолькер Дотш) предоставившей частично EHKS в Buchmann Института молекулярной Life Sciences (BMLS, режиссер Энрико Шлифф) в Гете Universität Франкфурт на Майне Немецким Исследовательским (DFG).

Materials

full grain wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: whole wheat flour, UK: whole meal flour
405 fine wheat flour Demeter e.V. 1.13E+08 US: pastry flour, UK: soft flour
inactive dry yeast Flystuff / Genesee Scientific 62-106
phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010-023
sodium hypochlorite, ~12% active Cl Sigma Aldrich 425044-250ML Caution: sodium hypochlorite is corrosive
low-melt agarose Carl Roth 6351.2
6-well plate Orange Scientific 4430500
24-well plate Orange Scientific 4430300
glass capillaries, internal Ø 0.46 mm Brand GmbH + Co KG 7087 09
SYTOX Green Thermo Fisher Scientific 57020 Staining solution preparation is explained in Table 2
YOYO-1 Iodide Thermo Fisher Scientific Y3601 Staining solution preparation is explained in Table 2
BOBO-3 Iodide Thermo Fisher Scientific B3586 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379 Staining solution preparation is explained in Table 2
Alexa Fluor 546 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22283 Staining solution preparation is explained in Table 2
sieve, 800 µm mesh size VWR International 200.025.222-051
sieve, 710 µm mesh size VWR International 200.025.222-050 for growth medium preparation (step 1.1)
sieve, 300 µm mesh size VWR International 200.025.222-040
sieve, 250 µm mesh size VWR International 200.025.222-038 for egg laying medium preparation (step 1.2)
glass dish, Ø 100 mm × 20 mm Sigma Aldrich CLS70165102
cell strainer, 100 µm mesh size BD Biosciences 352360
paint brush, head Ø 2 mm VWR International 149-2121
syringe, 1.0 ml B. Braun Medical AG 9166017V
scintillation vials Sigma Aldrich M1152-1000EA
paraformaldehyde Sigma Aldrich 158127 Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive
n-heptane ≥ 99% Carl Roth 8654.1 Caution: n-heptane is flammable and toxic
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML Caution: Trition X-100 is corrosive

References

  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on “Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487 (2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106 (2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head–a beetle’s view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416 (2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Génétique. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap’n’collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25 (2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25 (2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity–Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303 (2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082 (2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -. M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -. M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. . . Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059 (2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Génétique. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, &. #. 2. 7. 2. ;., Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27 (2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525 (2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73 (2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822 (2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705 (2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a., Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967 (2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635 (2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510 (2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555 (2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788 (2010).
  110. Patel, N. H. It’s a bug’s life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

Play Video

Citer Cet Article
Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos. J. Vis. Exp. (122), e55629, doi:10.3791/55629 (2017).

View Video