Summary

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Published: May 13, 2017
doi:

Summary

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

Abstract

Qui viene illustrato un protocollo su come effettuare misure di distanza interdette ad alta precisione utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) a livello di singola molecola nel modo di rilevamento a fluorescenza multiparametrica (MFD). MFD massimizza l'utilizzo di tutte le "dimensioni" della fluorescenza per ridurre gli artefatti fotofisicali e sperimentali e permette di misurare la distanza interdetta con una precisione fino a ~ 1 Å in biomolecole rigide. Questo metodo è stato utilizzato per identificare tre stati conformazionali del dominio ligando-legame del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA) per spiegare l'attivazione del recettore dopo legame legame. Quando si confrontano le strutture cristallografiche note con misure sperimentali, si sono accordati entro meno di 3 Å per biomolecole più dinamiche. Raccogliere un insieme di limitazioni di distanza che copre l'intera dimensionalità delle biomolecole permetterebbe di fornire un modello strutturale di biomoleculo dinamicoes.

Introduction

Un obiettivo fondamentale degli studi di biologia strutturale è quello di svelare il rapporto tra la struttura e la funzione delle macchine biomolecolari. La prima impressione visiva delle biomolecole ( es. Proteine ​​e acidi nucleici) si è verificata negli anni '50 attraverso la cristallografia a raggi X a sviluppo. La cristallografia a raggi X fornisce informazioni strutturali statiche ad alta risoluzione, vincolate dall'imballaggio in cristallo. Pertanto, l'immobilità intrinseca dei modelli strutturali a raggi X evita la natura dinamica delle biomolecole, un fattore che influenza la maggior parte delle funzioni biologiche 3 , 4 , 5 . La risonanza magnetica nucleare (NMR) 6 , 7 , 8 ha fornito una soluzione alternativa al problema risolvendo i modelli strutturali in soluzioni acquose. Un grande vantaggioDi NMR è la sua capacità di recuperare la natura dinamica intrinseca delle biomolecole e degli ensemble conformazionali, che aiuta a chiarire le relazioni intrinseche tra struttura, dinamica e funzione 3 , 4 , 5 . Tuttavia, NMR, limitato per dimensione del campione e grandi quantità di campioni, richiede strategie complesse di etichettatura per i sistemi più grandi. Pertanto, c'è una necessità urgente di sviluppare metodi alternativi nella biologia strutturale.

Storicamente, il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) 9 non ha assunto un ruolo importante nella biologia strutturale a causa del malinteso che FRET fornisce misure di distanza a bassa precisione. Lo scopo di questo protocollo è quello di rivedere la capacità di FRET di determinare le distanze sulla scala nanometrica, in modo tale che queste distanze possano essere utilizzate per la costruzione di modelli strutturali di biomolecole. La prima verifica sperimentaleLa dipendenza della R 6 dall'efficienza FRET è stata fatta da Stryer nel 1967 10 misurando poliproline di varie lunghezze come "righello spettroscopico". Un esperimento simile è stato raggiunto a livello monomolecolare nel 2005 11 . Le molecole di poliproline risultarono non ideali e quindi le molecole a DNA a doppio filamento sono state successivamente utilizzate 12 . Questo ha aperto la finestra per la misurazione precisa delle distanze e l'idea di utilizzare FRET per identificare le proprietà strutturali delle biomolecole.

FRET è ottimale quando la distanza di interdye è da ~ 0.6-1.3 R 0 , dove R 0 è la distanza di Förster. Per i fluorofori tipici utilizzati nei singoli esperimenti di FRET, R 0 è ~ 50 Å. Tipicamente, FRET offre molti vantaggi rispetto ad altri metodi nella sua capacità di risolvere e differenziare le strutture e le dinamicheI sistemi eterogenei: (i) A causa della massima sensibilità della fluorescenza, gli esperimenti FRET a singola molecola 13 , 14 , 15 , 16 possono risolvere complessi eterogene contando direttamente e caratterizzando simultaneamente le strutture dei singoli membri. (Ii) I percorsi complessi di reazione possono essere decifrati direttamente negli studi di FRET mono-molecolari perché non è necessaria alcuna sincronizzazione di un ensemble. (Iii) FRET può accedere a un'ampia gamma di domini temporali che durano più di 10 decenni nel tempo, coprendo un'ampia gamma di dinamica biologicamente rilevanti. Iv) Gli esperimenti FRET possono essere eseguiti in tutte le condizioni di soluzione, sia in vitro sia in vivo . La combinazione di FRET con microscopia a fluorescenza consente lo studio delle strutture molecolari e delle interazioni direttamente nelle cellule viventi 15 , 16 , </ Sup> 17 , 18 , 19 , anche con alta precisione 20 . (V) FRET può essere applicato a sistemi di quasi tutte le dimensioni ( ad es. Oligomeri poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp90 25 , reversi transcriptasi HIV 26 e ribosomi 27 ). Vi) Infine, una rete di distanze che contenga tutta la dimensionalità delle biomolecole potrebbe essere utilizzata per derivare modelli strutturali di molecole statiche o dinamiche 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Pertanto, la spettroscopia FRET a singola molecola può essere utilizzata per ottenere distanze sufficientemente precise da utilizzare per la modellazione strutturale a distanza 26 . Ciò è possibile sfruttando il rilevamento di fluorescenza multiparametri (MFD) 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , che utilizza otto dimensioni di informazioni di fluorescenza ( es. Spettro di eccitazione, spettro di fluorescenza, anisotropia, durata della fluorescenza, Tempo macroscopico, intensità della fluorescenza e distanza tra i fluorofori) per fornire precisi e precisi ritratti di distanza. Inoltre, l'eccitazione interpolata pulsata (PIE) è combinata con MFD(PIE-MFD) 42 per monitorare la fluorescenza dell'accettore di eccitazione diretta e per selezionare eventi a singola molecola derivanti da campioni contenenti uno stoichiometria donatore da accettazione a 1: 1. Una tipica configurazione PIE-MFD utilizza laser a eccitazione interpolati a due pulsanti collegati ad un corpo microscopio confocale, dove il rilevamento fotonico è suddiviso in quattro canali diversi in diverse finestre spettrali e nelle caratteristiche di polarizzazione. Ulteriori dettagli possono essere trovati nella Figura 1 .

È importante notare che la FRET deve essere combinata con metodi computazionali per ottenere modelli strutturali simili a quelli atomici che sono coerenti con i risultati FRET 26 , 30 . Non è l'obiettivo del presente protocollo di superare la metodologia associata per costruire modelli strutturali con distanze derivate da FRET. Tuttavia, questi approcci sono stati applicati in combinazione con altre tecniche ( ad esempio, dispersione a raggi X a piccole angolazioni)O risonanza paramagnetica dell'elettrone), dando vita al campo della biologia strutturale integrativa 43 , 44 , 45 , 46 . L'obiettivo attuale è quello di aprire la strada a FRET come strumento quantitativo nella biologia strutturale. Ad esempio, questa metodologia è stata usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante-legame (LBD) del recettore N-methyl-D-aspartato (NMDA). Il fine ultimo è quello di superare le limitazioni di cui sopra e di portare FRET tra i metodi integrativi utilizzati per la determinazione strutturale delle biomolecole fornendo distanze misurate con alta precisione.

Protocol

1. Preparazione del buffer PBS e trattamento della camera NOTA: Indossare un cappotto di laboratorio e guanti monouso durante l'esecuzione di esperimenti chimici bagnati. Utilizzare la protezione dell'occhio durante l'allineamento del laser. Preparazione del buffer PBS Sciogliere 4,5 g di Na 2 HPO 4 , 0,44 g di NaH2P04 e 3,5 g di NaCl in 400 ml di acqua distillata. Assicurarsi un pH di 7,5 e sterilizzare la soluzione auto…

Representative Results

Negli esperimenti tipici smFRET che utilizzano una configurazione MFD (linee laser: 485 nm a 60 μW e 640 nm a 23 μW, sezione 5.1), il campione di fluorescenza viene diluito a una concentrazione picomolare bassa ( 10-12 M = 1 pM) In un microscopio confocale, dove un impulso laser sub-nanosecondo eccita molecole etichette che diffondono liberamente attraverso un volume di eccitazione. Un volume confocale tipico è <4 femtolitri (fL). A tali basse concentrazioni, solo una si…

Discussion

In questo lavoro viene presentato il protocollo per allineare, calibrare e misurare le distanze interdite con alta precisione usando esperimenti FRET di una molecola PIE-MFD. Calibrando attentamente tutti i parametri strumentali, è possibile aumentare l'accuratezza delle distanze misurate e raggiungere l'accuratezza di Angstrom. A tal fine vengono utilizzati diversi istogrammi multidimensionali per analizzare e identificare le popolazioni per ulteriori caratterizzazioni. Utilizzando il tempo medio di macro per …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VJ e HS riconoscono il supporto da NIH R01 GM094246 a VJ. HS riconosce fondi di start-up dal Clemson University Creative Inquiry Program e dal Centro per le Tecnologie di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ottici presso l'Università Clemson. Questo progetto è stato inoltre sostenuto da una borsa di studio del Centro Keck per l'addestramento di bioscienza interdisciplinare dei Consorzi della Costa del Golfo (NIGMS Grant No. 1 T32GM089657-05) e dello Schissler Foundation Fellowship for Translational Studies di comuni malattie umane a DD. Il contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Salute.

Materials

charcoal Merck KGaA K42964486 320
syringe filter Fisherbrand 09-719C size: 0.20um
chambered coverglass Fisher Scientific 155409 1.5 borosilicate glass, 8 wells
microscope cover glass Fisher Scientific 063014-9 size: 24X60-1.5
Nuclease free water Fisher Scientific 148859 nuclease free
tween-20 Thermo Scientific 28320 10% solution of Polysorbate 20
acceptor DNA strand (High FRET) Integrated DNA Technologies 178124895 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
acceptor DNA strand (Low FRET) Integrated DNA Technologies 177956424 5´-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
donor DNA strand Integrated DNA Technologies 177951437 5´ -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
DNA strand (No FRET) Integrated DNA Technologies 5´ -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
thermal cycler Eppendorf E6331000025 nexus gradient
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide Thermo Scientific A10254 termed cyan-green fluorophore in the manuscript
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide Thermo Scientific A20347 termed far-red fluorophore in the manuscript
Rhodamine 110 Sigma-Aldrich 83695-250MG
Rhodamine 101 Sigma-Aldrich 83694-500MG
LB Broth, Miller Fisher Scientific BP1426 For culture of E. coli
Ampicillin Sigma-Aldrich A0166 Used at 100 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain plasmid selection
Tetracyline  Calbiochem 58346 Used at 12.5 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain gor (flutathione reductase) mutation in Origami B(DE3) strains to facilitate disulfide bond oxidation
Kanamycin Fisher Scientific BP906-5 Used at 15 ug/ml final concentration in selective LB medium to maintain trxB (rhioredoxin reductase) mutation in B(DE3) stains to facilitate disulfide bond oxidation
Origami B(DE3) Competent Cells Millipore 70837-3 Competent E. coli cells for expression of protein with disulfide bridges
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Fisher Scientific BP1755 For induction of E. coli protein expression
HiTrap Chelating HP GE Life Sciences 17-0409-01 For Large-scale FPLC Purification of His-tagged protein
Imidazole Sigma-Aldrich 56749
Ni-NTA Agarose  Qiagen 30210
PD-10 Desalting Column GE Life Sciences 17-0851-01
AktaPurifier GE Life Sciences 28406264 FPLC Instrument
Dialysis tubing Spectrum labs 132562 15 kD MWCO 24 mm Flath width, 10 meters/roll
Dichroics Semrock FF500/646-Di01-25×36 500/646 BrightLight
50/50 Beam splitter polarizer Qioptiq Linos  G33 5743 000 10×10 film polarizer
Green pass filer Chroma ET525/50m ET525/50m 25 mm diameter mount
Red pass filter Chroma ET720/150m ET720/150m 25 mm diameter mount
Power Meter ThorLabd PM200
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary300Bio
Fluorolog 3 fluorometer Horiba FL3-22-R3
Fluorohub TCSPC controller Horiba Fluorohub-B TCSPC electronics for ensemble measurements
NanoLed 485L Horiba 485L Blue diode laser
NanoLed 635L Horiba 635L Red diode laser
Olympus IX73 Microscope Olympus IX73P2F Microscope frame
PMA 40 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932200, PMA 40 Optimized for green detection
PMA 50 Hybrid Detector PicoQuant GmbH 932201, PMA 50 Optimized for ed shifter sensitivity
485nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-485
640nm laser PicoQuant GmbH LDH-D-C-640
Hydraharp 400 and TTTR acqusition software PicoQuant 930021 Picosecond event timer and Time Correlated Single Photon Coutning Unit, includes TTTR acqusition software
SEPIA II SLM 828 and SEPIA software PicoQuant 910028 Laser driver for picosecond pulses , includes SEPIA software controller.
computer Dell optiplex 7010 cpu: i7-3770 ram:16GB
FRET Positioning and Screening (FPS) software Heinrich Heine Unviersity It include the Accesibel Volume clacualtor available at http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
MFD suite Heinrich Heine Unviersity It includes the BIFL software package Paris; Margarita for visualization of the multiparameter hisotrams, and Probability Distribution Analysis software availabel at http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html

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Citer Cet Article
Ma, J., Yanez-Orozco, I. S., Rezaei Adariani, S., Dolino, D., Jayaraman, V., Sanabria, H. High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination. J. Vis. Exp. (123), e55623, doi:10.3791/55623 (2017).

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