Analyse van retinoïnezuur geïnduceerde neurale differentiatie van muis embryonale stamcellen in twee en drie-dimensionale embryoiden organen

SER afkomstig van de blastocyst binnenste celmassa. Deze cellen zijn pluripotent, dat wil zeggen zij hebben het vermogen om te differentiëren in elk celtype van het organisme van herkomst. ESC in vitro differentiatie is van groot belang als een experimenteel systeem voor het onderzoeken van ontwikkelingstrajecten en mechanismen. Het biedt een krachtige en flexibele modelsysteem om nieuwe therapeutische benaderingen voor de correctie van cellen en weefsels dysfunctie te testen. EBS recapituleren vele aspecten van celdifferentiatie tijdens de vroege embryogenese. In het bijzonder kan EBS worden gebruikt wanneer embryonische letaliteit bemoeilijkt de cellulaire basis van de embryonale gebreken ^{1, 2} bepalen. EBS kan hetzij worden gevormd door de hangende druppel of vloeibare suspensietechnieken ^3. Het voordeel van de eerste is de mogelijkheid om EB consistente grootte en dichtheid te genereren, waardoor experimentele reproduceerbaarheid vergemakkelijkt.

<p class = "jove_content"> interactie met extracellulaire matrix (ECM) adhesie eiwitten kunnen de motiliteit en overleving van hechtende cellen beïnvloeden. In de 2D-cultuur systeem, wordt fibronectine vaak toegepast op cel adhesie te verhogen tot het substraat. Fibronectine is een basale lamina component herkend door 10 soorten celoppervlak integrine heterodimeren ^4.

RA is een kleine lipofiele metaboliet van vitamine A die neurale differentiatie ^{5, 6} induceert. Hoge concentraties van RA bevorderen neurale genexpressie en onderdrukt mesodermale genexpressie tijdens EB vorming ^{7, 8.} RA wordt door vitamine A oxidatie tot retinaldehyde door een alcohol of retinol dehydrogenase, gevolgd door retinaldehyde oxidatie tot het uiteindelijke product door retinaldehyde dehydrogenase ^9. Neurale differentiatie vereist transport van RA uit het cytoplasma de kern van cellulaire RA-bindend eiwit 2 (CRABP2). In de kern, RA bindt aan de verwante receptor complex van een RAR-RXR heterodimeer ^10. Dit leidt tot rekrutering van transcriptionele co-activatoren, en initiatie van transcriptie ^{9, 11.} Bovendien RA bevordert de afbraak van gefosforyleerd (actieve) Smad1, dus tegenwerken van BMP en Smad signalering ^12. Naast deze activiteiten RA verhoogt Pax6 expressie, een transcriptiefactor die neuronale differentiatie ¹³ ondersteunt. RA signalering wordt gemoduleerd door sirtuine-1 (Sirt1), een nucleair nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) – afhankelijk enzym dat CRABP2 deacetylates interfereren met zijn translocatie naar de kern, en dus met RA binding aan de RAR-RXR heterodimeer ^{14, 15, 16.}

e_content "> Ons doel bij het ontwerpen van de RA-behandelde EB protocol hier beschreven neurale differentiatie optimaliseren om in vitro analyse van de signaleringspaden die ESC differentiatie reguleren in neuronale voorlopercellen te vergemakkelijken. Een voordeel van dit protocol is vergemakkelijking van de analyse van celfunctie door immunofluorescentie. 3D EB's niet goed gepenetreerd door antilichamen en moeilijk beeld. EB dissociatie in een 2D monolaag op specifieke tijdstippen tijdens neurale differentiatie bevordert immunokleuring en beeldvorming van de cellen met confocale microscopie.