JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Médecine

Лапароскопическая Техника для последовательного Сборнике печени и мезентериальных лимфоузлов макак

Published: May 02, 2017
doi:
10.3791/55617
, , , , , , , , , ,
1Department of Pharmaceutics,Washington National Primate Research Center, University of Washington, 2Division of Primate Resources,Washington National Primate Research Center, University of Washington

Summary

Здесь мы описываем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб печени и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) в макак, что позволяет увеличить частоту дискретизации, и уменьшает потенциал для хирургических осложнений, по сравнению с выполнением лапаротомии.

Abstract

В брыжеечных лимфатических узлов (MLN) и печень подвергаются воздействию микробов и микробных продуктов из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), что делает их уникальными иммунологически. Желудочно-кишечный тракт и связанные с ними МЛН сайты ранней вирусной репликации в вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) инфекции и МЛН вероятно важные участки пласта, которые укрывают латентно инфицированные клетки даже после длительной антиретровирусной терапии (АРТ). Печени были показаны, играют важную роль в иммунной реакции на лентивирусы и, как представляется, играют важную роль в оформлении вируса из обращения. Приматы (NHP) модель для ВИЧ и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) точно имитировать эти аспекты ВИЧ-инфекцию и последовательной продольной выборку первичных участков вирусной репликации и связанные с иммунными ответами в этой модели поможет выяснить важные события в инфекции, патогенез , а также влияние различных стратегий вмешательства на эти события. Теклор опубликованных методов образец печени и МЛН вместе включают основные операции и / или аутопсию, что ограничивает возможность исследовать эти важные сайты в последовательном режиме в том же животном. Ранее мы описали лапароскопический метод для сбора МЛН. Здесь мы описываем минимально инвазивную лапароскопическую технику для последовательной продольной выборки печени и MLN через те же двух мест портов, необходимых для сбора MLN. Использование одних и тех же двух портов сводит к минимуму воздействие на животных, так как не требуется никаких дополнительных разрезов. Эта методика может быть использована с повышенной частотой дискретизации по сравнению с основной абдоминальной хирургией и уменьшает потенциал для хирургических осложнений и связанная с ними местными и системными воспалительными реакциями, которые могли бы осложнить интерпретацию результатов. Эта процедура имеет потенциал для облегчения исследований с участием моделей NHP при одновременном повышении благосостояния животных.

Introduction

Желудочно – кишечный тракт (ЖКТ) является самой большой поверхностью слизистой оболочки тела и подвергается воздействию множества антигенов , полученных из пищи, патогенов и эндосимбиотических бактериальных сообществ , обычно упоминается как микробиом 1, 2. Брыжеечные лимфатические узлы (MLN) выравнивают желудочно-кишечный тракт и являются основным местом иммунной функции для стимулирования или воспалительные реакций толерогенных в направлении этих разнообразных антигенов. Физическая организация МЛН создает разобщенную систему , которая может реагировать на антигены локально , не вызывая системные реакции 3. Кроме того , кровь из водостоков GI тракта к печени путем воротной вены перед возвращением в оборот, и, таким образом , подвергается воздействию микробов и микробных продуктов , которые перемещал из желудочно – кишечного тракта в собственной пластинке слизистой оболочки и введенными в кровоток 4. Печени также функционирует в качестве вторичного лимфоидного органа ай имеет большое количество иммунных клеток, в том числе специализированных макрофагов, чтобы удалить микробы транслоцируется 5, 6. Таким образом, МЛН и печень являются основными иммунные органы подвергаются воздействию синантропных и патогенных бактерий из желудочно-кишечного тракта, а также среда антигенов из других источников, что делает их уникальными и важными с иммунологической точки зрения.

МЛН критические участки для оценки вирусологических и иммунологических эффектов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или патогенной обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) инфекции, и, вероятно, участвуют в начале распространения ВИО следующего ректального вызова. Gut-ассоциированной лимфоидной ткани , как известно, является основным местом постоянной репликации ВИЧ, несмотря на эффективный контроль виремии современными антиретровирусной терапии (АРТ) 7. В SIV моделей инфекции, МЛН были показаны, являются важными резервуарами латентного вируса и могутбыть первичным резервуаром 8, 9. Печени также имеет важное значение в лентивирусов инфекции, о чем свидетельствует накопление SIV специфических CD8 + Т – клеток в печени макак во время острой инфекции SIV 10. Кроме того, она является основным органом , ответственным за очистку вируса из обращения 11.

ВИЧ и SIV – инфекции связаны с измененной GI микробиоты, нарушена целостность эпителия ЖКТ и повышение транслокации микробов и микробных продуктов из толстой кишки на периферию и обращения 12, 13. Эти процессы связаны с местной и системной активацией иммунной системы , а также повышенная заболеваемость и смертность у ВИЧ – инфицированные индивидуумов 14. В SIV – инфекции, транслоцируются бактерия была обнаружена в MLN 15, в то время как накопление микрофонаrobial продукты в печени было показано , что приводит к воспалению и повреждению органа 16. Таким образом, в контексте ВИЧ и SIV инфекций, то МЛН и печень могут быть весьма информативными для понимания воспалительных процессов, работающих на GI-резидентах бактерий.

Здесь мы представляем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб MLN и печени в отличных от человека приматов (NHPS). Показано, успешное выполнение этой методики на двух здоровых женщин макак (СУР), отбор проб каждого животного два раза, с 160 дней между каждой операцией. Мы продолжаем использовать эти образцы для оценки и сравнения ключевых лейкоцитов и лимфоцитов в популяции каждого органа с помощью проточной цитометрии, и демонстрируют весьма последовательные данные между двумя временными точками.

Protocol

Животных содержали и воспитывающихся в ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных международных (AAALACi) аккредитованных объектов, а также все процедуры на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета штата Вашингтон и по Вашингтон, Национальный исследовательский центр Предстоятель. 1. Хирургическая подготовка, анестезии и анальгезии Седативный и индукционные Седативная макака с внутримышечной инъекцией 10 мг / кг кетамина и 0,015 мг / кг дексмедетомидина (в сочетании в одном шприце). Обеспечить отсутствие вывода рефлексов перед удалением из клетки. Интубации животного, и поддерживать животное в плоскости общей анестезии с использованием изофлурана (1,0 – 2,5%) и 100% кислорода. См ссылки для получения дополнительной информации относительно интубации и общей анестезии в макак 17,исх "> 18, 19. Обезболивание Поддержка и мониторинг Вставьте периферический венозный катетер и обеспечивают внутривенные изотонические жидкости (например, лактат Рингера раствор) со скоростью 5 мл / кг / ч в течение анестезии и хирургическое вмешательства. Применение стерильной глазной смазки, чтобы предотвратить сухость роговицы. Обеспечить обезболивание, например в виде композиции с замедленным высвобождением бупренорфина (0,2 мг / кг, подкожно). Примечание: НПВС (например, мелоксики или кетопрофен), также может быть обеспечено во время анестезиологического восстановления, при условии, что экспериментальный протокол допускает введение NSAID и что животное нормотензивное и хорошо увлажненный во время анестезии. Монитор глубины анестезии (например , челюсти тон), частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, ЭКГ, кровяное давление, пульс оксигенации, конец приливные CO 2, и температуру тела по всей анестезии и хирургического вмешательства. Примечание: Когда живот интраназально, животное может hypoventilate.Обеспечение механической вентиляции , если частота дыхания уменьшается, или конец приливного СО 2 уровня выше 45 мм ртутного столба. После операции, управлять Атипамезолом (0,15 мг / кг, внутримышечно) для разворота дексмедетомидина. Хирургическое Приготовление Выполните несколько клизмы теплой водой , чтобы уменьшить объем фекалий в толстой кишке , чтобы помочь визуализации и манипуляции кишечника во время процедуры 20. Используйте ножницы с числовым 40 лезвием для удаления волос из операционного поля. Бритье от реберного хребта до лобка и с левой стороны на правый фланг. Консервант подготовка операционного поля с использованием соответствующих антисептиков, такими как хлоргексидин-чередующихся спиртом или повидон-йод-спиртовыми скрабами. Поместите животное на операционном столе на его спинке, под углом на полпути между дорсальной и правой боковой лежачее. Свяжите руки и ноги веревкой в ​​выдвинутом положении. Обеспечить окончательный chlorhexiобедать и алкоголь приготовительного когда животное перемещается в операционном и позиционируется для хирургии. 2. хирургия Примечание: Для получения дополнительной информации о лапароскопии в мелких животных, см ссылка 21. Лапароскопическая Подготовка инструмента Драпируйте животное с стерильной фенестрированной драпировкой. С помощью нестерильного помощника, завернуть цифровую камеру с стерильной драпировкой камеры и подключите кабель к башне. Прикрепите жесткий объем к головке камеры. Присоедините стерильный свет кабель к жесткой рамке и подключите кабель к источнику света. Баланс белого камеры в соответствии с инструкциями изготовителя. Закрепить стерильную инсуфлятор трубку к инсуффлятору. Лапароскопическая Вход Используя # 15 скальпель с, сделать ~ 5 мм ножевого разрез через кожу на глубину брюшной мускулатуры, приложениеroximately 1 – 2 см слева от пупка. Использование не доминантную руки, поднимите брюшную стенку краниальна к месту пробивающего разреза. С доминирующей рукой, поместите кончик иглы Вереша через разрез и угол кончик краниально. Примечание: Угол проникновения иглы Вереша будет варьироваться в зависимости от состояния тела животного. Так, например, в жировой животного, игла Вереша необходимо будет вставлен почти перпендикулярно к брюшной стенке. В тонком животном, игла Вереша должна быть наклонена краниально, чтобы уменьшить риск контакта с внутренностями. Удерживая вал (не концентратор) иглы Вереша, плотно толкать иглу, чтобы проникнуть через брюшную стенку в брюшную полость. Отчетливый «щелчок» и уменьшение сопротивления будет ощущаться как острый кончик проникает в брюшину и тупой кончик иглы пружин Вереша вперед в брюшную полость. Примечание: Если игла проходит надлежащим образом в гое брюшной полости, будет небольшое сопротивление, когда она выдвигается и снимается 1 – 2 см. Подключение инсуфлятор трубки СО 2 к игле и открыть запорный кран. Давление в брюшной полости не более чем на 10-12 мм рт.ст. для создания пневмоперитонеума. Примечание: Живот достиг идеального вдувание, когда она расширилась симметрично и происходит потеря нормального резкого контура реберных краев. Давление должно обеспечить достаточное пространство для вставки канюли / троакара без риска контакта с внутренностями. Канюля Размещение После того, как живот полностью интраназален, сделать ~ 5 – 7 мм разрез с скальпелем # 15 через кожу левого краниального живота к брюшной мускулатуре ~ 2 – 4 см хвостовых до последнего ребра. Поместите 5 мм троакар-канюли сборку через разрез кожи и угла она ~ 45 – 60 градусов caudomedially. Проникнуть брюшную полость на глубину 1-2 см. Screж резьбовой канюли в брюшную полость путем поворота канюлю (~ 0,5 – 1 см) дополнительно на глубину 1,5 – 3 см, и удалить троакар. Удалите инсуфлятор трубку от иглы Вереша, выключить кран и удалить иглу. Подключение инсуфлятор трубки в канюлю и открыть запорный кран для поддержания пневмоперитонеума на уровне не более 10 – 12 мм рт. Вставьте жесткий объем через канюлю и в брюшную полость. Под визуализацией камеры, продолжают делать небольшой надрез с # 15 скальпелем через брюшную мускулатуру и брюшины на предыдущем разрезе кожи, используемый для введения иглы Вереша. Камера используются для визуализации брюшной стороны разреза, чтобы избежать сосудов и свести к минимуму кровотечения. Примечание: Убедитесь, что разрез через мышцы и брюшина достаточно велик, чтобы облегчить ввод зонда и экстериоризации брыжейки (~ 0,5 см). Большее Разрез может потребоваться экстериоризоваться mesentчень у животных с повышенным содержанием жира брыжеечного. Поместите животное в положении Тренделенбурга 21 с ногами повышенных примерно в 15 – 30 градусов выше головы. Это необязательно, но может облегчить доступ к брыжеечным лимфатическим узлам толстой кишки, как небольшой кишечному тракт будет двигаться к более черепному положению. Мезентериальная лимфатический узел Биопсия Под визуализацией камеры, вставьте твердый зонд через брюшной разрез, сделанный на этапе 2.3.5. Поместите зонд между сальником и кишечником и использовать радикальные движения, чтобы аккуратно смести сальник от кишечника, чтобы обеспечить визуализацию основной брыжейки. Продолжая использовать радикальные движения от хвостового к черепной части живота. Сальник может быть помещен в правой краниальной части живота, так что из операционного поля. Используйте зонд, чтобы переместить нисходящую ободочную кишку по направлению к левой или правой стенке брюшной полости. Это позволит лучше визуализировать тон брыжейки, чтобы помочь в поиске брыжеечных лимфатических узлов. С помощью зонда развертки через брыжейки, чтобы определить местонахождение брыжеечные лимфатические узлы вдоль толстой кишки и брыжеечных сосудов. Примечание: Толстокишечные узлы проходят по брыжеечной границе толстой кишки, левые колика узлы могут быть найдены вблизи точек ветвления сосудов, а нижние узлы брыжейки могут быть найдены вдоль нижних брыжеечных сосудов. Брыжеечные лимфатические узлы хорошо видны у худых животных. Когда утопают в брыжеечном жире они часто придают слегка поднятый, блестящий внешний вид покрывающую брыжейке и могут быть более более сероватым цветом загара, то окружающим брыжеечной жир. Кроме того, брыжеечные лимфатические узлы, как правило, лежат вдоль лимфатических сосудов и брыжеечных сосудистой сети. После того, как лимфатический узел идентифицируется, удалить зонд и вставить Мэриленд храповик щипцов в брюшную полость. Используйте пинцет, чтобы понять брыжейки смежны целевой узел. Потяните брыжейки к INCISion, и удалить сферу из канюли. Выключите инсуффлятор и оставьте канюли крана открыт для сброса давления на живот, чтобы облегчить экстериоризации брыжейки. Потяните брыжейки вне тела через разрез. После того, как выводило возьмитесь брыжейками с изогнутым кровоостанавливающими комариным или анатомическим пинцетом, чтобы обеспечить доступ через разрез. Определить лимфатический узел (ы) в пределах экстериоризированной брыжейки пальпации для тверже лимфатического узла и / или прямой визуализации Grayer цвета или узелкового появления лимфатического узла. После идентификации сделать небольшое отверстие (~ 3 – 5 мм) в брыжейке вблизи узла, используя изогнутые кровоостанавливающие зажимы. Бесплатные приложения к брыжейкам с помощью тупой диссекции с изогнутым кровоостанавливающими. Перевязывать сосудистый с 4-0 нерассасывающейся мононитью шва по мере необходимости. Используйте острое рассечение скальпеля, чтобы удалить лимфатический узел. Поместите узлы в Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 налед. Осмотрите выводили брыжейки кровотечения. Если кровотечение отмечено, обеспечивает соответствующий гемостаз окклюзии сосудов с кровоостанавливающими или лигатурами (4-0 неабсорбируемой мононить шовными), или путем использованием прижигания. Отпустите брыжейки и вдувать живот обратно до 10 – 12 мм рт.ст., чтобы брыжейки вернуться в брюшную полость. Повторите шаги 2.4.1 через 2.4.8, чтобы получить дополнительные биопсии лимфатических узлов. Биопсия печени Возвращает таблицу в горизонтальное положение. Поместите резьбовую канюлю в брюшную полость через разрез, ранее используемый для сбора биопсии лимфатического узла (разреза, сделанный на этапе 2.3.5). Убедитесь, что надрез достаточно большой (~ 5 – 7 мм), чтобы обеспечить размещение канюли без введения троакара. Вставьте жесткий объем через эту канюлю по направлению к краниальной брюшной полости и визуализировать черепной живот и печень. При визуализации камеры, вставьте биопсию пorceps через канюлю ранее размещенные в левой части живота (черепной разрез, сделанный на этапе 2.3.1). Для получения биопсии печени, место щипцов биопсии под выбранным краем лепестка печени с подвижной частью челюсти, обращенной к печени, откройте пинцет, и позволить запас, чтобы попасть в открытые челюсти. Убедитесь в том, что ни один сальник не между печенью и биопсийных щипцов. Отрегулируйте положение щипцов и закройте инструмент над требуемой областью выборки. Поддерживать давление в течение приблизительно 20 – 30 с, чтобы обеспечить гемостаз. С закрытого пинцетом, удалите образец осторожно потянув щипцы через канюлю. Это мягко разрывать биопсии из печени. Поместите биопсию печени в RPMI 1640 на льду. Примечание: Размер биопсии печени составляет примерно 5 мм х 2 мм х 2 мм с помощью 5 мм биопсийных щипцов. Изучите сайт биопсии для кровоизлияния с помощью визуализации камеры. Если наблюдается кровотечение, поместите солевой moistened стерильный ватный тампон через канюлю и оказать давление на место биопсии. В качестве альтернативы, упаковать участки биопсии стерильной гель пены, чтобы помочь гемостаза. Повторите шаги 2.5.3 через 2.5.5, чтобы получить дополнительные биопсии печени. Примечание: Здесь, 3 биопсий на одно животное в процедуре были собраны, которая является достаточной для всех последующих анализов. Повязка Изучить брюшную полость кровотечения. Примечание: Это не произошло до сих пор. Однако, если чрезмерное кровотечение отмечено, определить место кровотечения и обеспечить соответствующий гемостаз с помощью давления с стерильным ватным тампоном или использованием гелем пены. Выключите инсуффлятор и откройте канюля краны. Слегка ручное давление на живот, чтобы полностью сбросить давление в брюшной полости. Удалите канюли. Закройте каждый из брюшных разрезов стена с 1 до 2 простых швов на сайт. Рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный. Выполните блок выплеска путем размещения 0,1-0,3 куб.см бупивакаина в каждом надрез для местной анестезии перед закрытием кожи. Закройте кожу 1 – 2 захороненных узловыми швами (рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный) для каждого сайта. Ткань клей может быть нанесен. 3. Биопсия печени Обработка и анализ лимфоцит Хранить несколько кусков ткани печени (около 0,5 мм х 0,5 мм х 0,5 мм в размере) в криоконсервации труб, в предпочтительном растворе для хранения РНК и 10% формалин для будущих молекулярных и гистологических анализов. Поместите оставшиеся биопсии печени в 50 мл среды RPMI 1640 с добавлением 1x пенициллина / стрептомицина, 40 мкг / мл коммерчески доступного раствора коллагеназы и 4 мкг / мл ДНКазы в стерильном 250 мл пластиковую чашку с крышкой. Перемешивает энергично с помощью магнитной мешалки и мешалкой в ​​течение 1 ч при 37 ° С. Равномерно распределяют путем выливания переваренной ткани. Grинд расщепленной ткани (со стадии 3.1.1) в течение двух 70 мкм фильтров вписываться в двух 50 мл конических пробирок в суспензию отдельной клеток с использованием конца стерильных 5 мл шприца. Довести объем обеих труб до 50 мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1x пенициллина / стрептомицина (R10). Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте супернатант. Концентрат клеток в один 50 мл конической трубки путем суспендирования клеток из обоего труб в 5 мл R10 и объединения в один 50 мл конической пробирки. Доведите объем до 50 мл с помощью R10. Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить клеточный выход. Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клетки в 1 мл R10, равномерно распределить на две 5 мл круглодонных полистироловых пробирок и довести объем каждой пробирки до 4 мл с R10, для ориентации> 500000 клеток в каждой пробирке. Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте эльupernatant и ресуспендируют осадок клеток в 4 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). Центрифуга при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл PBS на вортексе мягко. Добавить 1,5 мкл фиксируемой мертвой клетки пятно. Инкубирую при комнатной температуре в течение 5 мин. Добавьте следующие неразбавленным поверхностные окрашивания антител в титрах, рекомендованных производителем: CD45-PerCP (клон D058-1283), CD3-PE-CF594 (клон SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (клон 2Н7), CD4-BV605 ( клон ОКТ4), CD8-BV570 (клон РПА-Т8), и CD14-BV785 (клон M5E2). Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 мин. Добавить 4 мл PBS и центрифуге при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 250 мкл 1% параформальдегида в PBS. Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты. Анализ клеточных популяций с использованием проточного цитометра как описано в ссылке 22.

Representative Results

Подробные методы обработки собранных лапароскопии MLN, а также клеточные выходы и частота лейкоцитов в этих органах были ранее сообщались , 13. На рисунке 1 показаны данные сотовой урожайности и жизнеспособности , сравнивающие MLN и биопсии печени , собранных в двух временных точках 160 дней за исключением двух здоровых женщин RMs с использованием этой лапароскопической техники. Мы обнаружили , что клеточный выход из MLN была значительно выше , чем из печени (р = 0,0021), в среднем 33,5 х 10 6 и 6,74 × 10 6 клеток , полученных, соответственно. Мертвые клетки Окрашивание и анализ методом проточной цитометрии показали, что> 90% клеток, выделенных из обоих органов были жизнеспособными. С помощью проточной цитометрии, мы оценили и сравнили обилие лейкоцитов и лимфоцитов в MLN и печени. Представитель схемы стробирования для печени показана на <strong> На рисунке 2, где мы впервые закрытого типа на отдельные клетки , чтобы исключить агрегаты, с последующим отбором только жизнеспособных клеток, а затем выбор из CD45 + клеток, и , наконец , CD3 + клеток. Из популяции CD3 +, мы оценивали распространенность CD4 + и CD8 + Т – клетки, в то время как мы оценивали содержания из CD14 + и CD20 + клеток из CD3- популяций. Представитель проточной цитометрии участков , показывающих CD45 + и CD3 + популяцию из MLN и печень обоих животных в день 0 и дня 160 показаны на рисунке 3, а на рисунке 4 показаны лейкоциты и лимфоциты содержаний для двух выборок два животных. МЛН показали значительно более высокие изобилие CD45 + клеток , чем делали печень ( в среднем 76,9% и 7,66% жизнеспособных клеток соответственно, P = 0,0002). Не удивительно, что МЛН показали значительно более высокие пропорции CD3 + Т – клеток (P0; 0,0001) и CD4 + Т – клетки (P = 0,0004). И наоборот, печень была значительно обогащенные для CD14 + лейкоцитов по сравнению с MLN (P = 0,0036). МЛН показали более высокие средний CD8 + Т – клеток, но это не было статистически значимым. Удивительно, но для этих двух животных оба органа продемонстрировал сходные содержания клеток CD20 + В. Клеточные выходы и содержания различных лейкоцитов и субпопуляции лимфоцитов из MLN в этом исследовании подтвердило ранее сообщались значение 23. Рисунок 1. Общая Клеточная Выход (вверху) и Жизнеспособность клеток (снизу) от Серийно Собранный MLN и печени Биопсию. МЛН показали значительно более высокие урожаи клеток, чем делали печень. Тем не менее, оба образца типа представлены широкие ячейки для последующих анализов. Жизнеспособность клеток, измеренный методом cytom потокаetrically с использованием фиксируемых мертвые клетки амина пятно, показал, что оба образца типа, как правило, получали> 90% жизнеспособность клеток после диссоциации ткани. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 2. Представитель проточной цитометрии Gating стратегии. Во-первых, агрегированные клетки были исключены, с последующим отбором только жизнеспособных клеток после окрашивания с использованием фиксируемых мертвых клеток амина пятно. Далее, CD45 + лейкоциты были выбраны, с последующим отбором CD3 + Т – клеток. Из популяции CD3 +, анализировали CD4 + и CD8 + Т – клетки. Из CD3 – населения, CD14 + и CD20 + клетки анализировали. Thi s стратегия стробирования была также использована для МЛН. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 3. Поток цитометрии участки из MLN и печени двух животных Продольно. МЛН и образцы печени были собраны 160 дней друг от друга для обоих животных. (А). МЛН CD45 + клетки (лейкоциты); (Б) Печень CD45 + клетки (лейкоциты); (С) МЛН + CD3 + клеток (Т – клетки); (D) Печень клеток CD3 + (Т – клетки). Для обоих животных, то МЛН показали более высокие пропорции CD45 + и CD3 + клеток по сравнению с печенью. Через время, частоты этих популяций были одинаковы для обоих животных.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. Рисунок 4. Частоты CD45 + клетки (слева) и различные лейкоцитарные и субпопуляции (справа) Через 23 индивидуальных выборок. В MLNs отображаются значительно большие частоты CD45 +, CD3 +, и CD4 + клеток, в то время как печень показали значительно более высокие частоты CD14 + лейкоцитов, демонстрируя уникальные функции каждого органа. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

Здесь мы демонстрируем минимально инвазивный метод для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, которые имели показатель успеха 100% в этих и других животных, не описанных в данном исследовании. Кроме того, использование этого метода на одних и тех же животных во времени не было связано с какими-либо побочными эффектами. В самом деле, не было никаких осложнений в результате использования этой методики в других когорт животных, которые были инфицированы ВИО, обезьяний / вируса иммунодефицита человека (SHIV) или вируса Зика (неопубликованные данные). Кроме того, эта операция оказалась успешной, даже у животных, которые ранее подверглись крупной абдоминальной хирургии, а также в животных с тромбоцитопенией (неопубликованные данные). Мы показали, что эти образцы могут быть собраны через те же два порта путем изменения местоположения камеры при переключении из MLN в печени избежать необходимости в дополнительных надрезов. Факторы , влияющие на сбор МЛН уже сообщалось ранее 13.

<pкласс = «jove_content»> До четырех сборников 3 МЛН и 3 биопсии печени каждого был проведен во время на отдельных животное без осложнений, изменения в показателях успеха, или изменения в собранных данные. Кроме того, эта лапароскопической техники коллекция / печени МЛН успешно сочетать с другими процедурами, такими, как сбор периферических лимфоузлов, эндоскопических верхних и нижних биопсий GI, аспирации костного мозга, спинномозговой сбора жидкости и венепункции в то же анестезирующего случае позволяющей обширной оценки вирусологические и иммунологические реакции в последовательной манере (неопубликованные данные).

Вся процедура обычно занимает 30 – 45 минут, чтобы закончить и осуществляется через два ~ 0,5 см надрезы. У тучных животных, это может быть необходимо, чтобы сделать больший разрез (~ 1 – 1,5 см), чтобы восстановить MLN через и может потребоваться дополнительное время для завершения. Животные с большим мезентериального жира часто требует значительного опыта в гifferentiate МЛН из окружающего жира. МЛН часто встречаются вдоль мезентериальных сосудов и, как представляется, более распространены вблизи точек ветвления в сосудах. Одним из важнейших аспектов этого метода является то, что она требует выбранный MLN, чтобы иметь достаточную подвижность в брыжейки, чтобы быть выводили через разрез брюшной стенки. В результате, этот метод не может быть использован для сбора МЛН близко к корню брыжейки. В связи с увеличением, это в разы легче идентифицировать МЛН с камерой, и захватывая в непосредственной близости от МЛН может помочь с расположением и идентификации узла после его выводили.

Использование положения Тренделенбурга не всегда может потребоваться для сбора МЛН, и если МЛН могут быть легко получены без использования позиции Тренделенбурга это может сделать биопсию печени легче, поскольку это позволит предотвратить органы от смещения краниально. Время от времени, после размещения в Тренделенбурга положение, печень смещается вверх к диафрагме и должен аккуратно манипулируют в исходное положение до сбора биопсии. По мере того как порт для размещения коллекции MLN находится слева, биопсия печени, как правило, взята из левой боковой и левой медиальной доли печени, поскольку они находятся ближе к канюле.

Собранные МЛН и биопсия печени при условии, урожаев широких клеток для различных последующих анализов и показала высокую жизнеспособность собранных клеток. Здесь клетки окрашивали для проточной цитометрии анализа лейкоцитов и лимфоцитов населения, а также основные различия между этими двумя важными иммунными органами были выяснены. Например, МЛН были высоко обогащены CD4 + Т – клетки по сравнению с печенью из – за важность MLN в качестве центральных точек для сбора и распространения адаптивных иммунных ответов, а также на важность CD4 + T для управления воспалительными и толерогенные ответы на среду антигенов, полученные из пищевого рациона и GI-резидентов микроорганизмовs = "Xref"> 24. Тем не менее, печень была значительно обогащенные для CD14 + лейкоцитов по сравнению с MLN. CD14 экспрессируется преимущественно на моноцитах и макрофагах и является ключевым компонентом рецепторного комплекса для бактериального липополисахарида (LPS) 25. Действительно, увеличение плазменной концентрации растворимого CD14 связаны с микробной транслокации и активации иммунной системы у ВИЧ и SIV патогенных инфекций 26. Таким образом, более высокие частоты CD14 + лейкоциты в печени , вероятно , является результатом большей бактериальной нагрузки в этом органе по сравнению с MLN.

Здесь мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивной хирургической техники для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, используя только две небольшие надрезы для лапароскопической записи, не привело к каким-либо неблагоприятных последствий. Эти образцы обеспечивают полезный путь для оценки ключевых процессов иммунологических, вирусологических и микробиологических, которые берут пнулисе в MLN и печени, которые являются отдельными и уникальными от системного иммунитета. Точно так же, биопсия печени имеет решающее значение для долгосрочной оценки последствий ВИЧ / SIV, лекарственной терапии, и транслокаций микробов, которые часто объединяются , чтобы вызвать существенное повреждение печени 16. Кроме того, поскольку МЛН печень и иммунные органы подвержены желудочно-кишечный микробиоценоз, способность оценивать иммунитет в этих органах через время обеспечивает отличную платформу для понимания той роли, которую играет микробиом в поддержании иммунного гомеостаза хозяина. Взятые вместе, оценка печени и МЛН имеет важное значение в контексте вакцин и терапевтических эффективностей, SIV вирусного клиренса резервуара и общего иммунитета слизистых оболочек. Возможность сбора этих образцов с помощью минимально инвазивного подхода означает, что существует меньший риск воспаления, связанные с процедурой, чем существует в настоящее время опубликованных методик и меньшим воздействием на физиологии животных. В фуры, мы будем оценивать потенциал, чтобы объединить коллекцию МЛН и печени с коллекцией селезенки через те же два места порта, чтобы обеспечить выборки другой важной и отдельной части иммунной системы, которая, как было показано, чтобы играть важную роль в ряд моделей заболеваний.

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана номер гранта P51OD010425 NIH.

Materials

Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment Patterson Veterinary 97-890-8152
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub Patterson Veterinary 07-842-6153
Vedco Alcohol, Isopropyl 70% Patterson Veterinary 07-869-6434
Vedco Vetadine Scrub Patterson Veterinary 07-869-6772
Hospira Lactated Ringer's 250 ml Patterson Veterinary 07-800-9325
Adolescent Laparotomy Surgical Drape Medline DYNJP3004
Access 40 L Insufflator Dyonics 7205832
300XL Xenon Light Source Dyonics 7206084
460P 3 – CCD Digital Camera with Head Dyonics 72200086
Universal Camera Drape, 7” x 96” Endoscopy Support Services ESS-6920
Universal Light Guide, 7.5 Ft Endoscopy Support Services US.OU225
Insufflator Tubing Endoscopy Support Services TM-102
Multipurpose Rigid Scope, 2.7mm x 187.5mm, 0 degree Endoscopy Support Services B30-0007-00
Exam and Protective Sheath for 2.7mm x 187.5mm scope with one fixed stopcock Endoscopy Support Services B10-0025-00
Rigid scope, 5mm x 300mm Endoscopy Support Services B30-0071-00
Veress Needle, 2mm x 80mm  Endoscopy Support Services 8302.08
Solid Probe with Markings, 5mm x 320mm Endoscopy Support Services 8383.661
Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5mm x 240mm   Endoscopy Support Services 8390.2054
Biopsy Forceps, 3.5mm X 310mm R. Wolf 8391.4063
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5mm x 60mm Endoscopy Support Services 8903.072
Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5mm x 60mm Endoscopy Support Services 8919.333
Blunt Tip Trocar Endoscopy Support Services 8903.101
Pyramidal Tip Trocar Endoscopy Support Services 8903.121
CO2 Airgas CD USPE
RPMI 1640 Fisher Scientific SH30027FS with L-Glutamine
RNAlater Stabilization Solution ThermoFisher Scientific AM7021
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
Liberase TM Research Grade Sigma Aldrich 5401119001 Commercially available colleganse solution
Dnase I from bovine pancrease Sigma Aldrich D5025
70 µm cell strainers Morganville Scientific CSS0200
5mL Syringe BD 309646
50mL Conical Centrifuge Tubes ThermoFisher Scientific 339652
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003
5mL Round-Bottom polystyrene tubes Fisher Scientific 14-959A
PBS Fisher Scientific SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit ThermoFisher Scientific L34957 Amine dead cell stain
CD45-PerCP (clone D058-1283) BD Biosciences 558411
PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) BD Biosciences 562406
BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) Biolegend 317438
APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) BD Biosciences 560179
PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) BD Biosciences 555624
BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) BD Biosciences 563698
16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN Fisher Scientific 50-980-487
LSR II Flow Cytometer BD NA
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
  3. Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
  4. Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
  5. Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
  6. Shuai, Z., et al. Adaptive immunity in the liver. Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).
  7. Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
  8. Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
  9. North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
  10. Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
  11. Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
  12. Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
  13. Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
  14. Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
  15. Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
  16. Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
  17. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. . Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , (2011).
  18. Flecknell, P. A. . Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , (2009).
  19. Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. . Lumb and Jones’ Veterinary Anesthesia and Analgesia. , (2007).
  20. Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. . Kirk and Bistner’s Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , (2012).
  21. Fransson, B. A., Mayhew, P. D. . Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , (2015).
  22. Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
  23. Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
  24. Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
  25. Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
  26. Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).

Tags

Laparoscopic TechniqueSerial CollectionLiverMesenteric Lymph NodesMacaquesMinimally InvasiveGI TractMicrobial TranslocationHIV BiologyImmunological ConsequencesPathologyMultiple Time PointsAnimal WelfareSterile ProcedureScalpel IncisionVarus NeedlePneumoperitoneumCO2 Insufflator

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Zevin, A. S., Moats, C., May, D., Wangari, S., Miller, C., Ahrens, J., Iwayama, N., Brown, M., Bratt, D., Klatt, N. R., Smedley, J. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. J. Vis. Exp. (123), e55617, doi:10.3791/55617 (2017).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image