Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em> Bacillus</em> -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

A expressão de proteína recombinante é amplamente utilizada para superar problemas associados a fontes de proteína naturais, tais como quantidades limitadas de proteínas e contaminação prejudicial. Além disso, nos estudos de genes patogénicos e proteínas, uma estirpe laboratorial alternativa que não requer precauções adicionais de segurança pode ser utilizada. Por exemplo, Bacillus cereus é um modelo útil para estudar Bacillus anthracis devido à sua estreita relação evolutiva ¹ .

B. anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação em seres humanos e gado e pode potencialmente ser utilizado como arma biológica ² . Assim, os estudos laboratoriais sobre B. anthracis são rigorosamente regulados pelos Centros de Controle de Doenças dos Estados Unidos, exigindo práticas de nível 3 de biossegurança (BSL-3), que determinam que a área do laboratório seja segregada com pressão negativa. Em contraste com B. anthracis </eM>, B. cereus é categorizado como um agente BSL-1 e, portanto, tem preocupações mínimas de segurança. B. cereus é um patógeno oportunista que, após a infecção, provoca intoxicação alimentar que pode ser tratada sem assistência médica. No entanto, uma vez que B. cereus partilha muitos genes críticos com B. anthracis , as funções das proteínas de B. anthracis podem ser estudadas utilizando os correspondentes homólogos de B. cereus ¹ .

O agrupamento de genes ba1554 – ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o agrupamento bc1531 – bc1535 De B. cereus , bem como com o grupo bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , em termos de organização e sequência de genes. Além disso, os primeiros genes ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dos respectivos clusters são absolutamente conservados ( isto é, 100% de identidade de sequência de nucleótidos), implyiUm papel crítico do produto gênico nas espécies de Bacillus . Devido à sua localização nestes agrupamentos de genes, ba1554 foi mal identificado como um suposto transcrição regulador [ ^3] . No entanto, a análise da sequência de aminoácidos do produto ba1554 indica que pertence à família MazG, que tem actividade de nucleótido pirofosfoidrolase e não está associada à actividade do factor de transcrição ^{4 , 5} . Embora as proteínas pertencentes à família MazG sejam diversas em relação à sequência e ao comprimento globais, partilham um domínio MazG comum de ~ 100 resíduos caracterizado por um motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" significa qualquer resíduo de aminoácido e o número Indica o número de resíduos X).

O domínio MazG nem sempre representa diretamente uma determinada atividade catalítica. Um membro MazG de Escherichia coli (EcMazG) possui dois domínios MazG, mas emO domínio MazG C-terminal é enzimaticamente activo ⁶ . Além disso, a especificidade do substrato de enzimas MazG varia de nucleosídeos trifosfatos não específicos (para EcMazG) para dCTP / dATP específicos (para integrados MazG) e dUTP (para dUTPases) ^{6 , 7 , 8 , 9} . Por conseguinte, são necessárias análises biofísicoquímicas da proteína BA1554 para confirmar a sua actividade NTPase e para decifrar a sua especificidade de substrato.

Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo que a maioria dos laboratórios sem uma instalação BSL-3 pode seguir para caracterizar o produto proteico do gene B. cereus bc1531 , que é um ortholog de B. anthracis ba1554 , a nível molecular. Resumidamente, BC1531 recombinante (rBC1531) foi expresso em E. coli e purificado utilizando um marcador de afinidade. Para experimentos cristalográficos de raios X,Zação da proteína rBC1531 foram selecionadas e otimizadas. Para avaliar a actividade enzimática de rBC1531, a actividade de NTPase foi monitorizada colorimetricamente para evitar nucleótidos marcados radioactivamente que foram convencionalmente utilizados. Finalmente, as análises dos dados biofísico-químicos obtidos nos permitiram determinar o estado de oligomerização e os parâmetros catalíticos de rBC1531, bem como obter dados de difração de raios X a partir do cristal rBC1531.