Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.
İlk gelişimsel model olarak tanıtılan Zebra balığı, diğer pek çok alanda popülerlik kazanmıştır. hızla gelişen organizma çok sayıda büyütme kolaylığı, embriyonik optik netlik ile birlikte, bu modelin ilk zorlayıcı nitelikleri olarak görev yaptı. Son yirmi yılda, bu modelin başarısı daha da büyük ölçekli mutajenez ekranlarına kendi uyumluluğuyla ve transgenesis kolaylığı ile tahrikli edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, gen düzenleme yaklaşımlar modelinin gücünü genişletmiştir.
nöro çalışmalar için, zebra balığı embriyo ve larva birden çok yöntem uygulanabilir olan bir model sunmaktadır. Burada, nöronların, elektrik eksitabiliteye temel bir özelliğinin çalışma izin yöntemleri üzerinde durulacak. Zebra balığı spinal nöronların elektrofizyolojik çalışma için Bizim hazırlık bir kayıt odasına hazırlık sabitlemek için veteriner dikiş tutkal kullanımını içerir. kayıt için alternatif yöntemlerzebra balığı embriyolarının ve larva ince bir tungsten pimi 1, 2, 3, 4, 5, kullanılarak bölmesine hazırlama eki içerir. O kadar 4 larva dorsal tarafına monte etmek için kullanılmış olsa da bir tungsten pim çoğunlukla, bir yanal yönde hazırlama monte etmek için kullanılır. dikiş tutkal her iki doğrultuda embriyolar ve larvaları monte etmek için kullanılmıştır. tutkal kullanılarak, en az bir diseksiyon ve böylece sonuç olarak ortaya çıkan zarar vermeden, bir enzimatik işlem kullanılmadan spinal nöronlar erişimi sağlayan, gerçekleştirilebilir. Ancak, larva için, omuriliği çevreleyen kas dokusu çıkarmak için kısa bir enzim tedavisi uygulamak gerekir. Burada tarif edilen yöntemler, birçok developmentà motor nöronlar, internöronlar ve duyu nöronlarının içsel elektriksel özelliklerini incelemek için kullanılmıştırL 6, 7, 8, 9 aşamaları.
George Streisinger, omurgalı gelişimi 10 genetik analizi için bir model sistem olarak yaygın zebrabalıkları olarak bilinen Danio rerio kullanımını öncülük etmiştir. Model de dahil olmak üzere birçok avantaj sunmaktadır: (1) nispeten basit ve pahalı olmayan bir hayvancılık; (2) dış gübreleme, erken olgunlaşma aşamalarındaki embriyolar kolay erişim sağlayan; ve (3) saydam bir embriyo, oluştuklarında hücreler, dokular ve organlarda doğrudan ve tekrar gözlemler imkan verir.
takip eden yıllarda, birçok ilerlemeler daha da zebrabalıkları modelin gücünü artırmıştır. Özellikle, ileri genetik ekranlar ve tam genom dizileme çabalar çok gelişim süreçleri 11, 12, 13, 14 mutasyonlar ve kritik genlerin tanımlanmasında önemli roller oynadığı,"> 15, 16. Gateway klonlama yöntemleri transkripsiyon aktivatörü gibi (TALENS) ile örneklenen,. Transgenik rutin bir uygulama 17, 18 yaklaşır genom düzenleme son ilerlemelere ve kümelenmiş düzenli aralıklı bırakılmış kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) -Cas9 nükleazlar, mutasyonların hedeflenen giriş için izin, hem de knock-out ve knock-in 22. Kombine, bu yöntemler Zebra balığı belirli davranışları ve çok sayıda insan hastalıkların altında yatan genetik mekanizmaların çalışma için güçlü bir model yapmak, 21, 20, 19 yaklaşır 23, 24, 25, 26, 27.
Bu eser geliştirmek odaklanırZihinsel düzenleme ve nöronal gelişim elektriksel aktivitenin rolü. Odak Zebra balığı modeli çeşitli avantajlar sağladığı için omurilik üzerindedir. Birincisi, embriyonik ve larva aşamasında zebrafish erişmek için nispeten kolaydır; Dolayısıyla, bir eksik nöronlar ve daha basit devreyi 28, 29 sahip gelişimsel aşamalarında omurilik fonksiyonunu çalışabilirsiniz. Ayrıca, zebra balığı omurilik transkripsiyon karakteristik ve ayırt edici desen ile gösterilir, 30, 31, 32, 33, 34, 35 faktörler gibi diğer omurgalı benzer nöronların, çeşitli bir grubu vardır.
omurilik devrelerinin fonksiyonunu altında yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak amacı zebrafish çalışmaların büyük çoğunluğu, özelliklelokomosyonunu destekleyen olanlar, anlaşılır larva aşamalarında 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 odaklandık. Bununla birlikte, omurilik lokomotif ağları oluşturan nöronların çok erken evrelerinde de farklılaşmasını başlatmak, ~ 9-10 saat sonra fertilizasyon (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. Bu bakışa göre, spinal nöronların morfolojik ve elektriksel özellikleri ortaya ve embriyonik ve larva aşamaları arasında değişiklik bir Overa için önemli olan, anlamayarak nasıllokomotor devre oluşumu ve işlevi ll anlama.
Burada tarif edilen yöntemler, diseksiyon spinal nöronların yama kelepçe kayıtları sağlamak ve başarılı bir şekilde embriyonik aşamada (~ 17-48 büyük büyütme) ve larva aşamalarında (~ 3-7 gün sonra döllenme [dpf]) de uygulanmıştır. Bu yaklaşım ilgi nöronların erişim sağlamak için gereken diseksiyon miktarını sınırlar. Protokol kayıt odasına embriyo ya da larva takmak için, oldukça ince bir tungsten iğnesi, kullanılan bu veteriner dikiş yapıştırıcı zebra balığı, spinal nöronların kayıt için diğer yayınlanmış yöntemlerin çoğunda farklıdır. İki farklı yaklaşımların kullanılabilirliği (yani, tungsten pimi karşı sütür tutkal) elektrofizyolojik analizi için zebrafish embriyolar veya larva monte etmek için alternatif seçenekler araştırmacılar kendi özel deneysel hedeflere ulaşmak için sağlar.
İlk olarak, bir pop erişmek ve kayıt prosedürleri birincil duyu nöronlarının ABS ayarlaması, Rohon-Sakal hücreler tarif edilir. Bu nöronların hücre gövdeleri dorsal omurilik içinde yalan. Rohon-Sakal hücreleri, çok sayıda omurgalı türlerinde de mevcuttur erken gelişim ayırt ve embriyonik dokunun yanıtı 6, 44, 47, 48 altında yer alır.
İkinci olarak, erişim ve spinal motor nöron kayıt prosedürleri ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Zebra balığı spinal motor nöronlar nöron iki dalgaları sırasında ortaya çıkar. Daha önce doğumlu primer motor nöronların hemisegment 45, 46, 49 başına mevcut 3-4 primer motor nöron, gastrülasyon (~ 9-16 HPF) sonunda ortaya çıkar. Bunun aksine, ikinci motor nöron Daha sonra doğan popülasyonu daha çok ve ~ 14 büyük büyütme başlayarak uzun bir süre sırasında ortaya çıkanef "> 45, 50. orta gövde bölümlerinin sekonder motor nöron oluşum en çok 51 büyük büyütme 50 ile tamamlanır. İkincil motor nöronlar amniotları motor nöronlarının muadili olarak kabul edilir 46. İlginç bir şekilde, omurga üstünde nöronlar, dopamin ile, lokomosyon düzenleyen larva ve ikinci motor nöron oluşumu embriyo ve genç larva 50, 51. birincil ve ikincil motor nöronlar her biri birçok farklı alt tipi içerirler. her bir primer motor nöron alt tipi projeleri basmakalıp bir sonuçlanan karakteristik kas grubu uyaran çevresel bir akson, aksonal yörünge tanımlanması. Genel olarak, ikinci motor nöronlar, daha önce birinci motor nöronlar tarafından kurulan aksonal yolları takip ederler. bu nedenle, aksonal yörüngeleri ile ilgili olarak, birinci ve ikinci motor nöronların haricinde, benzer olduğu aksonal kalınlığı ve somata boyutuprimer motor nöronlar 45 için daha büyük yeniden.
Üçüncüsü, internöron birkaç türlerinden kayıt için yöntemler tartışılmaktadır. Bununla birlikte, bu gibi durumlarda, diğer omurilik hücreleri çıkarılması için sınırlı bir miktarda gereklidir ve bu nedenle omurilik Rohon-Sakal hücreleri veya motor nöron kayıtlar için daha az sağlamdır.
Burada tarif edilen yöntemler, omuriliğin en az diseksiyon sonra zebra balığı embriyolarının duyu ve motor nöronların elektriksel ve morfolojik özelliklerini belirlemek için izin verir. Nöronlar, en az 1 saat, bu kayıtların üzerine uygulanan süre sağlıklı kalması. Nöronlar, standart tam hücre konfigürasyonu kullanılarak kaydedilmiştir da çekirdekli yamalardan gibidir; ikinci yöntem iyon akımlarının 9 detaylı bir biyofiziksel çalışma engelleyebilirler yer kelepçe…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, (ABR'ye RLM ve R01NS25217 ve P30NS048154 için F32 NS059120) NIH hibe ile desteklenmiştir.
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | ||
Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | ||
Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | |
a-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | ||
Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | ||
Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye | |
Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | ||
Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | ||
Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer | |
Petri dishes | Falcon | 351029 | ||
Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) | |
Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) | |
Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | ||
Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | ||
Collagenase XI | Sigma | C7657 | ||
Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | ||
Head stage | Molecular Devices | CV203BU | ||
Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | ||
Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) | |
Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | ||
Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | ||
Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | ||
Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | ||
40x/0.80w Achroplan objective | Zeiss | |||
Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 – Clampex and Clampfit | ||
Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Dissection and Recording Solutions(in mM) | ||||
All solutions, except the intracellular, are stable for ~ 2 – 3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | ||||
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20°C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | ||||
Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | |||
Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | |||
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | |||
Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~ 100 µl) and store at -20°C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Immobilizing agents | ||||
0.4 % ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2M Tris, pH9 (0.4 g Tricaine/100 ml 0.2 M Tris | |||
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20°C. | ||||
For use, dilute the stock solution ~ 25 fold in embryo media | ||||
250 μM α-bungarotoxin | Prepare a 250 μM stock in ddH2O (1 mg/500 μl), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | ||||
1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 ml), prepare 100 µl aliquots, and sotre at -20°C. | |||
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. |