用放射性标记的ATP测定蛋白激酶活性
Summary
蛋白激酶是对于细胞间和细胞内信号转导至关重要的高度进化的信号酶和支架。我们提出了通过使用放射性标记的三磷酸腺苷（[γ- 32 P] ATP）测量激酶活性的方案，这是一种有助于阐明细胞信号调节的可靠方法。
Abstract
蛋白激酶能够响应于复杂的刺激阵列来控制大规模细胞变化，并且大量努力旨在揭示其调节的变构细节。激酶包括信号网络，其缺陷通常是多种形式的癌症和相关疾病的标志，使得能够操纵上游调节因子的测定平台和对于改进治疗学的研究至关重要的反应要求的验证。在这里，我们描述了一个基本的激酶测定，可以很容易地适应特定的实验问题，包括但不限于测试生物化学和药理学的作用，遗传操作如突变和缺失，以及细胞培养条件和治疗探针细胞信号传导机制。该测定使用放射性标记的[γ- 32 P] ATP，其允许定量比较和清楚的结果可视化，并且可以是mod如果用于免疫沉淀或重组激酶，特异性或典型的底物，在广泛的反应条件下使用。
Introduction
蛋白激酶是将细胞信号传递到适当的反应中所必需的复杂酶。鉴于其在维持体内平衡和预防或促进疾病状态方面的作用2 ，用于评估激酶活性的生物化学方法继续是描绘真核信号传导3的特征的有力工具。尽管使用磷酸特异性抗体的策略在测量不同治疗条件对细胞信号传导状态的影响方面已经具有高度的信息，但激酶测定允许直接根据激酶的酶活性来测量不同治疗条件的影响利益。虽然对于不使用放射性物质的类似测定法有几种选择5 ，我们仍然依靠这种方法对结果进行稳健的定量。那里是该测定的两个典型应用，两者都有价值的不同原因：免疫沉淀（IP）激酶测定（ 图1 ）和重组蛋白激酶测定（ 图2 ）。
IP激酶测定对于识别能够激活特异性蛋白激酶的因子以及测量抑制性治疗条件非常有用。简言之，将感兴趣的表位标记的激酶转染到培养的真核细胞中，进行各种处理，免疫沉淀，并测定将放射性标记的磷酸掺入模型底物（ 例如髓磷脂碱性蛋白（MBP））的能力。也可以通过免疫沉淀内源蛋白或任何数量的基因组编辑技术来进行IP激酶测定而不诉诸过表达。因为治疗是在文化中进行的，所以这种方法可以检测通过多个上游因素传播的刺激或通过体外读出的平行通路。该方法的一个主要优点是其不需要在其中直接上游或下游因子或磷酸化位点的先验知识。此外，一旦已经鉴定了感兴趣的激酶的特异性底物，与重组组分可以使用相同的激酶测定方案，以测量与天然底物的比活性，并在与质谱分析结合时鉴定特异性磷酸化位点。使用底物突变体的激酶测定可以进一步验证以这种方式鉴定的位点。最后，该方法也可用于检测和测量自磷酸化。
这里提供的方案假设用于在培养细胞中表达感兴趣的亲和标记的激酶的优化的蛋白质纯化方案或转染方法。有关转染，裂解，免疫沉淀和蛋白质纯化的更详细的论述我们建议参考Cold Spring Harbor Protocols 6 。有关测定开发和修饰的更多信息，请参阅蛋白质磷酸化：选择的酶学方法7 。
Protocol
Representative Results
Discussion
激酶是一种多样化的蛋白质家族，其在多种情况下已经发展了广泛的功能，激酶测定在研究几种信号蛋白方面已经非常有用，并且极大地有助于我们目前对细胞通信的理解。值得注意的是，尽管在结构和活性上存在重大差异，但使用相同的基本测定来表征两种不同的激酶。 WNK1激酶含有非典型催化口袋，临界赖氨酸转移到独特的位置，已知通过激酶和脚手架功能调节阳离子氯化物共转运蛋白的作?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢Cobb实验室的所有现任和前任成员有价值的工作和讨论，Dionne Ware提供行政协助。这些研究得到了National Institutes of Health Grant R37 DK34128和Welch Foundation Grant I1243对MHC的支持
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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