Быстрое и рафинированное CD11b Магнитная изоляция первичной микроглии с повышенной чистоты и универсальности

Микроглия являются Myb-независимые макрофаги резидентов мезодермального происхождения, отличающие от с-Kit + / CD45- erythromyeloid клеток – предшественников в крови островках желточного мешок ^{1, 2.} После того, как эмбриологические микроглии колонизировали на центральную нервную систему (ЦНС), они переходят из амебоидных к разветвленной форме ^3. Эти взрослые микроглии классифицируются как Surveillant , поскольку их динамические последствия зондировать здоровую паренхиму мозга для потенциальных оскорблений ^4. Хотя микроглии только способствуют примерно 10% населения ЦНС клеток, их способность плитки между собой обеспечивает максимальное сканирование паренхимы ^{4, 5.} Опасность-ассоциированные молекулярные структуры (DAMPS), такие как альфа-синуклеин ^{6, 7} и амилоид-бета, ⁸ или рathogen-ассоциированные молекулярные структуры (PAMPs) , такие как липополисахариды (LPS) ^9, классически активации микроглии для содействия воспалительного ответа , характеризующийся реверсии в активное состояние амебоидной и производство оксида азота, фактора некроза опухоли-альфа (ФНО), интерлейкин 1 & beta ; (ИЛ-1β), ИЛ-6, ИЛ-12, и хемокинов CC мотив лиганда 2 ^{9, 10, 11.} В нейровоспалительных условиях , таких как болезнь Паркинсона, в котором патогенные α-синуклеина накопил, нейродегенеративного цикл создается из смерти дофаминергических нейронов, которые высвобождают более агрегированный альфа-синуклеина, дальнейшее продвижение классической активации микроглии ^7. Подобно периферических макрофагах, микроглии может также иметь возможность альтернативно активировать в присутствии анти-воспалительных цитокинов IL-4 и IL-10, что дает им сильнодействующимIAL продвижения нейронную ремонта и ослабления воспаления ^{2, 11.} Помимо своих иммунологических ролей в ЦНС, микроглии были описаны как жизненно важные регуляторы нейронной цепи, сокращая синапсов в процессе разработки. Так , например, у мышей KO Cx3cr1- имеет менее плотные микроглии и снижение синаптической обрезку, что приводит к переизбытку дендритных шипов, незрелых синапсов и электрофизиологических моделей неразвитого ЦНСА ^12. Понимание этих физиологических сложностей и разнообразные функциональные роли микроглии в гомеостазе ЦНС имеет решающее значение для поиска терапевтических средств, ориентированных на нейродегенеративных расстройств.

В области нейроиммунологии, в пробирке эксперименты весьма желательны из – за большей возможности для механистических исследований, более низкие затраты на техническое обслуживание, а также за то , что меньше времени и трудоемким. Furthermoповторно, способность изолировать популяции клеток имеет решающее значение для очерчивания функциональных возможностей этих клеток-мишеней при заданных условиях. Существует множество способов микроглии изоляции, но они ограничены по своей способности получать относительно высоких количеств и чистоты для широких экспериментов ^{13, 14, 15.} Например, кластер дифференцировки 11b (CD11b) является общим поверхностным маркером моноцитов, макрофагов и микроглии ^16. При эксплуатации CD11b, метод магнитной сепарации был впервые описан как подход колонке на основе , которая давала ~ 99,5% чистоты и ~ 1,6 × 10 ⁶ микроглии в неонатальном мозге ^17. В нашей лаборатории недавно разработала CD11b магнитный метод разделения без колонн ^15, который мы провели в полистирольной трубке, помечая CD11b с моноклональным антителом , конъюгированным с фикоэритрином (PE). Биспецифическое SecondaRy антитела к РЕ и декстран комплексы с ПЭ. После связывания, декстран покрытием магнитные частицы вводятся, которые связываются с декстрана конце комплекса антитела. Наконец, полистирола пробирку помещают в магнит для микроглии изоляции. Этот подход в два раза выход до ~ 3,2 × 10 ⁶ микроглии в неонатальном мозге , но за счет снижения чистоты до ~ 97%.

В данном случае мы демонстрируем быстрый и рафинированный без колонн CD11b магнитной сепарации протокола (Рисунок 1). Этот усовершенствованный метод остается, насколько это возможно, как наш оригинальный метод без колонн, так как цена комплекта магнитной сепарации CD11b является то же самое. Время завершения уменьшается в два раза, что может иметь решающее значение для максимизации выживаемости клеток и выход. Следует отметить, что чистота достигается с этим оптимизированным метода составляет ~> 99%, значительное улучшение по чистоте , достигнутой от первоначального способа без колонн , разработанного нашей лабораторией ^15. Самое главное, что CD11b-PEне используется, исключая необходимость инкубировать в защищенном от света и позволяет использовать красный канал для флуоресцентной микроскопии. И, наконец, как в оригинальном способе CD11b, астроциты фракции с высоким выходом и чистоты получается с этим усовершенствованным способом. Астроциты являются наиболее многочисленные глиальные клетки в ЦНС, что приводит к тому , что их гомеостатические функции являются обязательными в отношении патофизиологии ^18. Эти глиальные клетки играют важную роль в различных физиологических функций, таких как формирование гематоэнцефалический барьер, обеспечивая питательную поддержку, поддерживая нейромедиатора гомеостаза, образуя глиальные рубцы в ответ на повреждение, нейропротекции, обучения и памяти, а также нейровоспаления, иллюстрирующих их следственную потенциал в глиальных биология ^19. Морфология и функциональность микроглии и астроцитов уже было установлено с помощью конфокальной микроскопии, Вестерн-блоттинга, количественное в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР QRT), GРисс анализа нитрита, а также мультиплексной цитокин анализа Luminex. Уточнение предусмотрено этот протокол обеспечивает повышенную уверенность , относящуюся к микроглии или астроцитов чистоты, более широкому применению флуоресцентной микроскопии с наличием красного канала, а также экономит время, все из которых имеет важное значение для экспериментов в пробирке.