Analyses Cell Lineage et des études de fonction de gènes à l'aide Twin-tache marcm

Le cerveau, composé d'un grand nombre et la diversité des types de neurones, dote les animaux avec la capacité de percevoir, de traiter et de répondre aux défis du monde extérieur. Neurones de la drosophile adulte cerveau central sont dérivés d'un nombre limité de cellules souches neuronales, appelées neuroblastes (NBS), au cours du développement ^{1, 2.} La plupart des NBs participants dans le cerveau neurogenèse chez la drosophile subissent la division asymétrique pour générer NBs d'auto-renouvellement et les cellules ganglionnaires mères (MGC), et les CMG ensuite passer par une autre série de division pour produire deux cellules filles qui se différencient en neurones ³ (figure 1A ). En raison de la complexité de la morphologie neuronale et les défis associés à l'identification des neurones spécifiques, une technologie d'étiquetage mosaïque positif, l'analyse de la mosaïque avec un marqueur cellulaire répressible (marcm), a été inventé pour permettre à l'visualization d'un seul neurone ou un petit sous – ensemble de neurones de la population de neurones environnants non marqués ^4.

Marcm utilise la flippase (FLP) / système cible de reconnaissance de FLP (FRT) pour médier une recombinaison site-spécifique entre les chromosomes homologues dans une cellule précurseur de séparation portant un allèle hétérozygote d'un gène répresseur, dont l' expression normalement inhibe l'expression d'un gène rapporteur ^4. Après la division mitotique des chromosomes recombinants sont isolés dans des cellules jumelles, de telle sorte qu'une cellule contient des alleles homozygotes du gène répresseur et l'autre cellule n'a pas de gène répresseur expression du rapporteur dans la cellule (et ses descendants) ne soit plus ⁴ bloqué. Trois modèles clonales sont habituellement trouvés dans une expérience de marcm quand FLP est induit stochastiquement en NBs ou CMG: une seule cellule et deux cellules-GMC clones, qui représentent la morphologie neuronale au resolutio une seule cellulen, et multi-cellulaire-NB clones, qui révèlent entiers modèles morphologiques de neurones dérivés d'un NB commun (figure 1B). La technique de marcm a été largement appliquée dans des études neurobiologiques de Drosophila, y compris l'identification du type de neurones permettant de reconstruire des réseaux de câblage du cerveau entier, des analyses de la lignée neuronale de la divulgation de l'histoire du développement des neurones, la caractérisation phénotypique des fonctions de gènes impliqués dans la spécification du destin cellulaire et la morphogenèse neuronale et étudie la différenciation ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Étant donné que les étiquettes classiques marcm une seule des deux cellules filles (et les lignées) après l'événement de recombinaison mitotique induite, des informations potentiellement utiles depuis le côté non marqué est perdue. Cette limitation empêche l'application de la base MSystème ARCM à haute résolution analyse de nombreuses lignées neurales qui changent le destin des cellules dans le tempo rapide ou à la précision des analyses des fonctions des gènes dans les neurones identiques de différents animaux ^{11, 12.}

Twin-tache marcm (tsMARCM) est un système avancé qui marque les neurones dérivés d'un ancêtre commun avec deux couleurs distinctes, ce qui permet la récupération des informations utiles à partir des deux côtés des cellules jumeaux, surmontant ainsi la limitation du système marcm ¹¹ initial ( Figure 2A – 2C). Dans le système tsMARCM, deux ARN interférence (ARNi) à base suppresseurs sont situés au trans-sites de chromosomes homologues dans une cellule précurseur, et l'expression de ces suppresseurs inhibent l'expression indépendamment de leurs reporters respectifs (figure 2B). Après mitotique recombinaison spécifique de site à médiation par le système FLP / FRT, le twsuppresseurs à base RNAi-o devenus séparés en cellules doubles pour permettre l'expression des journalistes distincts (figure 2B). Deux modèles clonales, une seule cellule associée à des clones monocellulaires et deux cellules-GMC associés aux clones multicellulaire-NB, sont généralement considérés dans une expérience tsMARCM (figure 2C). Informations dérivé d'un côté des cellules jumelles peuvent être utilisées comme référence pour l'autre côté, ce qui permet à haute résolution des analyses lignage neural, telles que la naissance à jour des neurones marqués, et analyse phénotypique des neurones identiques dans différents animaux pour l'enquête précise la fonction du gène de neurones ^{11, 12.} Ici, nous présentons un protocole étape par étape décrivant la façon de mener une expérience tsMARCM, qui peut être utilisé par d' autres laboratoires d'élargir leurs études sur le développement neuronal (ainsi que le développement d'autres tissus, le cas échéant) chez la drosophile.