Los análisis de linaje celular y el gen de Estudios de la función Uso MARCM Twin-situ

El cerebro, compuesto de un gran número y diversidad de tipos de neuronas, dota a los animales con la capacidad de percibir, procesar y responder a los desafíos del mundo externo. Las neuronas del adulto Drosophila cerebro central se derivan de un número limitado de células madre neuronales, llamadas neuroblastos (NBS), durante el desarrollo ^{1, 2.} La mayor parte del NBS participar en la neurogénesis del cerebro en Drosophila someterse a la división asimétrica para generar RN auto-renovación y células madre ganglio (GMCs), y los GMC y luego ir a través de otra ronda de división para producir dos células hijas que se diferencian en neuronas ³ (Figura 1A ). Debido a la complejidad de la morfología neuronal y los retos asociados con la identificación de las neuronas específicas, una tecnología de etiquetado mosaico positivo, análisis de mosaico con un marcador de células que se puede reprimir (MARCM), fue inventado para que el visualization de una sola neurona o un pequeño subconjunto de neuronas de la población de neuronas, sin etiqueta alrededores ^4.

MARCM utiliza el objetivo de reconocimiento de FLP sistema / (FRT) para mediar en la recombinación específica de sitio entre cromosomas homólogos en una célula precursora de separación que lleva un alelo heterocigoto de un gen represor, cuya expresión normalmente inhibe la expresión de un gen indicador ⁴ flipasa (FLP). Después de la división mitótica, los cromosomas recombinantes se segregan en las células individuales, de tal manera que una célula contiene alelos homocigotos del gen represor y la otra célula no tiene represor gen la expresión del reportero en esa celda (y sus descendientes) ya no es ⁴ bloqueado. Tres patrones clonales se encuentran generalmente en un experimento MARCM cuando FLP se induce estocásticamente en NBS o GMC: unicelulares y dos celdas-GMC clones, que representan la morfología neuronal en resolutio de una sola célulan, y multi-celular NB-clones, que revelan patrones morfológicos enteras de neuronas derivadas de un NB común (Figura 1B). La técnica MARCM se ha aplicado ampliamente en Drosophila estudios neurobiológicos, incluyendo en la identificación del tipo neuronal para la reconstrucción de las redes de cableado en todo el cerebro, los análisis de linaje neuronal para la divulgación de la historia del desarrollo de las neuronas, la caracterización fenotípica de las funciones de los genes implicados en la especificación del destino celular y morfogénesis neuronal y la diferenciación estudia ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Debido MARCM convencional sólo etiquetas una de las dos células hijas (y linajes) después del evento mitótico recombinación inducida, la información potencialmente útil desde el lado no marcado se pierde. Esta limitación impide la aplicación de la M básicoARCM sistema de análisis de alta resolución de muchos linajes neuronales que activan las células destinos en tempo rápido o para la precisión de los análisis de las funciones de genes en las neuronas idénticas de diferentes animales ^{11, 12.}

Twin-punto MARCM (tsMARCM) es un sistema avanzado que etiqueta neuronas derivadas de un antepasado común con dos colores distintos, lo que permite la recuperación de la información útil de ambos lados de las células individuales, superando así la limitación del sistema MARCM original de ¹¹ ( Figura 2A – 2C). En el sistema tsMARCM, dos interferencia de ARN (RNAi) a base de supresores están situados en trans sitios de cromosomas homólogos dentro de una célula precursora, y la expresión de los supresores de inhibir de forma independiente la expresión de sus respectivos reporteros (Figura 2B). Después de recombinación específica de sitio mediada por mitótico a través del sistema FLP / FRT, el twsupresores o basados en el ARNi se segregan en células individuales para permitir la expresión de los periodistas distintas (Figura 2 B). Dos patrones clonales, de una sola célula asociada con clones de una sola célula y de dos células-GMC asociados con clones multicelular-NB, se ven típicamente en un experimento tsMARCM (Figura 2C). La información derivada de un lado de las células individuales se puede utilizar como referencia para el otro lado, permitiendo de alta resolución análisis de linaje neural, tales como el nacimiento-data las neuronas marcadas, y análisis fenotípico de las neuronas idénticas en diferentes animales para la investigación precisa de la función génica neural ^{11, 12.} A continuación, presentamos un protocolo paso a paso que describe cómo llevar a cabo un experimento tsMARCM, que puede ser utilizado por otros laboratorios para ampliar sus estudios sobre el desarrollo neuronal (así como el desarrollo de otros tejidos, en su caso) en Drosophila.