Protocolos para gerar linhagens mutantes HPSC usando a plataforma iCRISPR e diferenciar hPSCs em células ß-like glicose-responsivos são descritos. Combinando tecnologia de edição de genoma com a diferenciação HPSC-dirigida fornece uma plataforma poderosa para a análise sistemática do papel das determinantes da linhagem no desenvolvimento humano e progressão da doença.
Interrogando a função do gene em auto-renovação ou diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferece uma plataforma valiosa para a compreensão do desenvolvimento humano e dissecar os mecanismos da doença em um prato. Para capitalizar sobre esta aplicação potencial requer ferramentas de edição de genoma eficientes para gerar mutantes HPSC em genes associados à doença, bem como in vitro protocolos de diferenciação HPSC para produzir tipos de células doenças relevantes que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Uma plataforma de edição de genoma eficiente para hPSCs chamado iCRISPR foi desenvolvido através da segmentação TALEN mediada de uma cassete de expressão Cas9 no locus AAVS1. Aqui, são descritos os protocolos para a geração de linhas Cas9 HPSC indutíveis utilizando células cultivadas num meio quimicamente definido e livre de uma condição de alimentação. Os procedimentos detalhados para utilizar o sistema iCRISPR para knockout gene ou alterações genéticas precisas em hPSCs, seja através de nem homóloga extremidade de união (NHEJ) ou através de alterações de nucleótidos precisos utilizando um modelo de reparação dirigida por homologia (HDR), respectivamente, estão incluídas. Estes procedimentos técnicos incluem descrições de concepção, produção e transfecção de RNAs guia CRISPR (gRNAs); a medição da taxa de mutação por meio de ensaios CRISPR ou T7E1 RFLP; ea criação e validação de linhas mutantes clonais. Finalmente, procedimentos crônica de diferenciação HPSC em células beta-pancreáticas como glicose-responsive imitando no desenvolvimento embrionário de pâncreas vivo. Combinando tecnologia iCRISPR com a diferenciação HPSC dirigido permite que o exame sistemático da função do gene para promover nossa compreensão dos mecanismos de desenvolvimento e doença diabetes pancreáticas.
As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs) têm a capacidade de se auto-renovar ambos e dão origem a todos os derivados das três linhagens germinais embriónicas. Eles fornecem um recurso valioso para a terapia de substituição celular e modelagem de doença, servindo como uma plataforma única para recapitular processos celulares em um contexto de desenvolvimento humano. Eles são também uma fonte de células experimentais para análises escaláveis, de alto rendimento. No entanto, o progresso tem sido limitado devido a dois desafios principais: a falta de ferramentas de modificação genética eficientes e a dificuldade em recapitulando as etapas de desenvolvimento embrionário complexos em um prato de cultura.
A modificação genética é uma ferramenta indispensável para estudar a função do gene em desenvolvimento normal e doença. No entanto, enquanto gene clássica visando abordagens através de recombinação homóloga tem provado ser uma ferramenta poderosa para dissecar a função do gene de rato em células estaminais embrionárias (mESCs) 1, esta abordagemtem sido extremamente ineficiente quando aplicada para hPSCs 2, 3. A recente adesão rápida de nucleases programáveis, específicas do local da natureza para uso em laboratório, incluindo nucleases de dedo de zinco (ZFNs), transcrição ativador-like nucleases efetoras (TALENS), e os aglomerados regularmente intercaladas repete palindr�icas curtas (CRISPR) / CRISPR-associados (CAS) sistemas 4, significa que a engenharia genoma tornou-se uma tarefa muito mais fácil, em uma grande variedade de microrganismos e linhas de células, incluindo em hPSCs. Estas ferramentas de edição gene de tirar vantagem do facto de que as nucleases quiméricos, tais como a endonuclease Cas9 pode permitir que uma ampla gama de modificações genéticas através da indução de quebras de cadeia dupla (DSB) em locais precisos, provocando a endógeno máquinas de reparação do ADN para activar quer não homóloga acabar juntar (NHEJ) ou reparação dirigida por homologia (HDR). Ambos os mecanismos podem ser explorados para a manipulação genética através da indução de either inserção aleatória e mutações de deleção (indels; via NHEJ), para criar mutações frameshift que anulam alelos do gene, ou substituições de nucleotídeos precisos (via HDR), a recapitular mutações do paciente para modelar doenças humanas ou para corrigir uma mutação causadora da doença para a terapia genética .
CRISPR / engenharia genoma CAS-mediada requer dois componentes: a constante de endonuclease de Cas9 guiada por ARN necessárias para a clivagem de ADN e ARN de um CRISPR variável (crRNA) e duplex de trans-activação (tracrRNA) que especifica o reconhecimento alvo de ADN. O duplex crRNA / tracrRNA pode ser substituído com um único ARN quimérico guia (gRNA), que foram encontrados para trabalhar mais eficientemente 5, 6, 7. Embora o sistema de / Cas9 CRISPR foi adaptada para os organismos mais experimentais e linhas celulares, o fornecimento e expressão de Cas9 e gRNA varia de forma significativa e deve ser optimizadas para Achieve edição genoma eficiente em muitos sistemas, incluindo hPSCs 8. Uma plataforma de edição de genoma eficiente, iCRISPR, foi criada em hPSCs 5. Neste sistema, uma abordagem TALEN mediada tem sido utilizado para segmentar os dois alelos do AAVS1 "transgene de locus de porto seguro" em trans, um alelo com um transactivador reverso controlado por tetraciclina (M2rtTA) e o outro com um elemento de resposta a tetraciclina (TRE ) que conduz a expressão de Cas9 (iCas9) nas hPSCs. Em linhas clonais estabelecidos (iCas9 hPSCs), Cas9 é altamente expressa com o tratamento doxiciclina. Entretanto, devido ao seu tamanho pequeno (100 nt), gRNAs únicas ou múltiplas podem ser facilmente entregue em iCas9 hPSCs com alta eficiência e pode dirigir Cas9 para a clivagem específica do local, permitindo eficiente disrupção do gene NHEJ-mediada, bem como HDR mediada modificações precisas de nucleótidos na presença de modelos de doadores curtas de ADN de cadeia simples (ADNcs). O sistema pode ser iCRISPRutilizada com sucesso para gerar um painel de linhas HPSC-simulando doença com bialélico (homozigota ou heterozigota composto) ou mutações heterozigóticas de perda de função em importantes genes de desenvolvimento 5, 9. Enquanto um número de grupos relataram edição gene eficiente usando CRISPR / Cas em hPSCs, o sucesso continua a ser limitada a um pequeno número de laboratórios adeptos da tecnologia. A plataforma iCRISPR oferece uma solução eficiente, mas simples para edição gene rotina por pesquisadores de diferentes níveis de habilidade, e já tem sido utilizado em uma série de estudos publicados por nosso grupo e outros 9, 10, 11, 12. Esta abordagem tem também sido alargado para silenciamento indutível com base na expressão de dCas9-KRAB 13.
Junto com o progresso de edição de genoma technologia, melhorias significativas também foram alcançados na manutenção HPSC e diferenciação dirigida. Condições de cultura para hPSCs evoluíram a partir de condições do meio do mouse irradiado fibroblastos embrionárias (IMEF) às condições de livre-feeder sobre componentes da matriz extracelular definidos, e de formulações de meios complexos dependentes de alimentador química definida 14. Tais melhorias reduziram a variabilidade na hPSCs devido a diferenças de lote para lote em componentes de substituição de preparação e soro knockout IMEF, e, assim, proporcionar um ambiente mais reproduzível para a diferenciação HPSC. Enquanto isso, um melhor conhecimento das vias de sinalização que regulam o desenvolvimento embrionário humano, bem como as descobertas de exames de drogas de alto rendimento, levaram ao aperfeiçoamento de protocolos de diferenciação 15, 16, 17, 18. Estes protocolos mais de perto imitar em vivo etapas de desenvolvimento e gerar tipos de células que recapitulam de perto os seus homólogos em vivo. Para a diferenciação HPSC na linhagem de pâncreas, protocolos iniciais imitou o desenvolvimento pancreático precoce relativamente bem, mas eventualmente gerado células p polyhormonal que eram de fenótipos fetais imaturos e responderam mal ao estímulo da glicose. Os avanços recentes 16, 17, 19, 20, têm permitido a geração de células beta-pancreáticas como glucose-responsivo, que nos permitirão investigar acontecimentos posteriores, como a formação e ainda a maturação de células beta monohormonal.
Aqui, nós pormenor a aplicação de linhas modificada do genoma para o estudo do desenvolvimento pancreático combinando o sistema iCRISPR com a diferenciação in vitro plataforma baseada em direcção HPSC pancr glucose-responsivocélulas beta-like eatic. Este acoplamento de poderosas ferramentas de edição genoma com uma melhor protocolo de diferenciação HPSC não só oferece a velocidade ea escala necessária para atender à crescente demanda por validar a causalidade da doença, mas também permite manipulações genéticas sofisticadas para novas investigações mecanicistas para controlo da transcrição subjacentes ao desenvolvimento normal e de doenças 9 .
Considerações de tempo para gerar mutantes Lines
Embora as abordagens recentes baseados em sistemas / Cas CRISPR para edição genoma levaram a segmentação bem sucedida, uma plataforma mais eficaz e universal seria preferível em maior escala análises da função do gene. A plataforma iCRISPR oferece um método rápido e eficiente para introduzir mutações a qualquer gene de interesse 5, 9. Em primeiro lugar, o método de síntese gRNA com base em PCR permite a produção de centenas de gRNAs em formato dispostos em um dia sem os passos de clonagem que consomem tempo. Em segundo lugar, com expressão indutível Cas9 doxiciclina em iCas9 hPSCs, o passo que envolve a transfecção gRNA requer apenas uma quantidade mínima de trabalho, e assim, as experiências de segmentação múltipla gRNA podem ser realizadas simultaneamente. Em terceiro lugar, devido à alta eficiência de segmentação atingíveis com o nosso sistema, a análise de ~ 24 – 48 colónias por gRNA transfectadas devem ser suficient para estabelecer múltiplos monoalélicos e linhas mutantes bialélicos para um único gene, embora as eficiências variam dependendo do locus alvo. Uma vez que é possível que um indivíduo treinado para apanhar mecanicamente 384 colónias (placas de 4 x 96 poços) de uma só vez, o que deve levar ~ 4 h, sob um microscópio de dissecação, um indivíduo treinado pode ser esperado para gerar linhas mutantes que afectam a 12 genes dentro 1 – 2 meses. A geração de mutantes simplificada HPSC num curto espaço de tempo permite a análise sistemática de uma série de factores de transcrição e / ou componentes da via de sinalização, que interagem uns com os outros, regulando o processo de desenvolvimento 9. Além disso, eficiente segmentação gene multiplexada também abre a porta para investigar interacções genéticas subjacentes características humanas complexas.
Geração de modificações genéticas precisas
A derivação de iPSCs específicas no doente, desde tipo de célula somática facilmente acessível s e a diferenciação em tipos de células doença relevantes fornecem uma grande oportunidade para a validação funcional de mutações associadas à doença. No entanto, devido à variabilidade considerável no fundo genética entre os indivíduos, as comparações directas entre iPSCs de doentes e de dadores saudáveis podem não permitem distinguir fenótipos da doença a partir de efeitos de fundo. Portanto, é necessário gerar iPSCs isogénicas controlo corrigindo a mutação da doença de volta para a sequência do tipo selvagem ou para introduzir as mutações específicas de pacientes em um fundo HPSC de tipo selvagem, tal como proposto por outros 25, 26. Além disso a (null) mutações de perda de função, pode-se agora dissecar mais precisamente os mecanismos da doença por meio da introdução de uma alteração de sequência específicos do paciente no locus endógeno em hPSCs, incluindo paciente hipermórficos, hipomórfico, neomorphic, ou dominante negativo mutações.
ntent "> modificação genética precisa emprega HDR para reparação de DSB, na presença de um modelo de reparação. Uma vez que é muito menos eficiente do que a reparação de NHEJ de ADN mediada por, um plasmídeo dador contendo a mutação específica para cada paciente, uma cassete de selecção de droga, e os braços de homologia tenha sido previamente utilizado como o modelo de reparação 2. Após a selecção de drogas e de verificação da mutação específica para cada paciente, um segundo passo é geralmente necessária para remover a cassete de selecção de droga. Embora os sistemas Cre-loxP e FLP-FRT mais amplamente usados deixar para trás sequência residual no locus endógeno, o uso de piggyBac transposão tem permitido a remoção contínua da cassete de selecção de droga 27. Mais recentemente, os modelos de ADNcs curtas também foram exibidas para suportar HDR eficiente com as endonucleases de ADN modificadas 28. Comparado com um plasmídeo dador , ADNcs podem ser directamente sintetizados e, portanto, evita o passo de clonagem demorado. Aqui, tem serPT mostraram que, por co-transfecção de gRNA e um molde de ADNcs para induzir a reparação dirigida por homologia, iCRISPR pode ser utilizada para introduzir modificações de nucleótidos específicos com elevada eficiência. Isto é crítico, não só para dissecar o papel dos nucleótidos essenciais dentro de domínios funcionais de proteínas, mas também para a modelagem de mutações de doenças humanas e potencialmente corrigir estas mutações associadas à doença para a intervenção terapêutica. Devido ao grande número de loci de susceptibilidade que estão cada um associado com várias variantes de sequência, modelar doenças complexas e multigénicos tais como diabetes tem sido um desafio para os geneticistas. À medida que a plataforma iCRISPR é permissiva para a rápida geração de uma série de alelos ou para direccionamento do gene multiplexable, que pode facilitar a investigação de múltiplos loci associados à doença, quer individualmente ou em combinação com fundos isogénicas.Segmentação Eficiências e efeitos fora do alvo
Nós temos encontrado uma boa correlação entre a T7E1 e os resultados do ensaio de RFLP e o número de linhas mutantes identificados por sequenciação. Isso enfatiza a importância da realização destes ensaios em paralelo com o estabelecimento de linhas clonais. Embora as eficiências de segmentação obtidos podem variar de acordo com os loci genómico, na maior parte das experiências individuais de direccionamento de gene, a 20 – 60% dos clones foram encontrados com ambos os alelos mutados (incluindo em grelha e mutações frameshift) 9. Nos casos em que a segmentação gene multiplexado foi realizada, clones mutantes bialélicos triplos com 5-10% de eficiência foram obtidos 5. ADNcs mediada por HDR de vários genes foram também realizados para obter alterações genéticas precisas, com as eficiências de obtenção homozigótica knock-in clones variando de 1 – 10% 5. Trabalhando com CRISPR / Cas em hPSCs, quaisquer mutações em potenciais locais fora do alvo que não compartilham a mesma sequência alvo gRNA estão ainda a ser detectadolass = "xref"> 5, 9, 12. Sequenciamento de genoma completo realizado em um estudo recente também não conseguiu identificar mutações off-alvo substanciais em linhas HPSC clonais gerado usando CRISPR / Cas 29. No entanto, para minimizar qualquer efeito potencial de confundir os fenótipos introduzidos por mutações em locais de efeitos fora do alvo, sugere-se para gerar linhas mutantes independentes utilizando, pelo menos, duas sequências de direccionamento gRNAs independentes diferentes dentro do mesmo gene. fenótipos semelhantes observadas em várias linhas gerada utilizando diferentes gRNAs poderia descartar principalmente a possibilidade de que o fenótipo trata de um efeito fora do alvo.
-Feeder dependente versus cultura independente e Segmentação
Os métodos tradicionais de cultura HPSC envolvem a sua manutenção e expansão de células de alimentação em meios contendo soro ou substituição de soro que inclui prod animaistos, tais como albumina de soro bovino. células alimentadoras, soro, de substituição de soro, e albumina todos contêm componentes complexos, indefinidos e mostrar considerável variabilidade lote. Adaptar-se a condição de livre de alimentação e química definida reduz significativamente os esforços para a manutenção HPSC e, mais importante, aumenta a consistência dos experimentos de diferenciação. Actualmente, existem muito poucos estudos que descrevem procedimentos de edição de genoma sobre hPSCs cultivadas em condições de cultura totalmente definidos 30. Encontramos maior CRISPR visando eficiência quando gRNA transfecção e deposição clonal foram realizadas em condições livres de alimentação em comparação com condições de cultura dependentes de alimentação. Acreditamos que este é devido ao aumento da sobrevivência das células após a transfecção e propagação de uma única célula para formação de colónias. Além disso, as células alimentadoras foram anteriormente mostrado para sequestrar os reagentes de transfecção, diminuindo assim a eficiência da transfecção.
combinandoEdição genoma com Directed Diferenciação
Protocolos de diferenciação anteriores produziram apenas uma pequena fracção das células de insulina positivas, a maioria das quais eram polyhormonal e assemelhava-se células fetais endócrinas 23. O progresso recente tem permitido a diferenciação de hPSCs em células mais maduras de glicose-responsive beta-like 16, 17, 19, 20. Podemos rotineiramente obter pelo menos 75% de células da endoderme definitivo, 40% células beta como glicose-responsive Pdx1 + NKX6.1 + progenitoras pancreáticas, e cerca de 20% NKX6.1 + CPEP + usando HUES8 hPSCs 9. Quando combinado com o sistema de edição genoma iCRISPR, este protocolo de diferenciação mais robusto tem facilitado a análise de fatores de transcrição que são cruciais para as pancreáticas progenitoras e endócrinos estágios de diferenciação do pâncreas. Isso fará com queSerá possível, em estudos futuros, para examinar um grande número de genes de doenças candidato para a validação funcional e investigação sobre os mecanismos que estão por trás diabetes 9.
Aplicações futuras ou Directions
Nosso sistema iCRISPR pode facilitar a geração de modificações genômicas mais complexas, tais como a criação de alelos repórter através do gene alvo usando modelos de DNA longo doadores marcas que codifica a proteína ou repórteres fluorescentes 12 HDR-mediada. Mostrámos que, devido à alta eficiência de segmentação CRISPR obtidos no sistema, este processo pode ser realizado em hPSCs, sem a necessidade de seleccionar mais de um fármaco 12. Além disso, o gene multiplexado segmentação pode ser usado para investigar interacções genéticas doença humana complexa subjacente, como mostrado em nosso estudo recente, o que acreditamos ser o primeiro exemplo desse trabalho 31. iCRISPR também pode ser utilizada para compreender o controlo regulador do gene através da criação de deleções em qualquer ARN não codificadoras ou em regiões reguladoras do gene, tais como promotores e intensificadores. Para gerar mutantes reguladoras eficientemente usando iCRISPR, gRNAs pode ser concebido para interromper o local de ligação de uma proteína de ligação de ADN, incluindo, mas não se restringindo à maquinaria de transcrição basal, ou um factor de transcrição específico de tecido. ADNcs HDR mediada por molde pode também ser utilizada para mutar locais específicos de ligação a proteínas. Finalmente, prevemos que uma maior optimização possa permitir a utilização da plataforma iCRISPR em hPSCs superiores para as análises genéticas de rendimento de fenótipos pluripotência ou fenótipos da doença quando combinado com um protocolo de diferenciação in vitro, em. Estes estudos mediada por iCRISPR pode permitir a identificação mais rápida de genes candidatos e os estudos da sua relevância funcional associada à doença.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH / NIDDK (R01DK096239) e New York State Stem Cell Science (NYSTEM C029156). ZZ foi apoiado pelo pós-bolsa NYSTEM do Centro de Biologia de Células-Tronco do Kettering Institute Sloan.
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |