Summary

Визуализация белокбелковых взаимодействия в ядерной и цитоплазматических фракций Co-иммунопреципитации и<em> В Ситу</em> Пробирной Расстояние Лигирование

Published: January 16, 2017
doi:

Summary

Protein-protein interactions can occur in both the nucleus and the cytoplasm of a cell. To investigate these interactions, traditional co-immunoprecipitation and modern proximity ligation assay are applied. In this study, we compare these two methods to visualize the distribution of NF90-RBM3 interactions in the nucleus and the cytoplasm.

Abstract

Protein-protein interactions are involved in thousands of cellular processes and occur in distinct spatial context. Traditionally, co-immunoprecipitation is a popular technique to detect protein-protein interactions. Subsequent Western blot analysis is the most common method to visualize co-immunoprecipitated proteins. Recently, the proximity ligation assay has become a powerful tool to visualize protein-protein interactions in situ and provides the possibility to quantify protein-protein interactions by this method. Similar to conventional immunocytochemistry, the proximity ligation assay technique is also based on the accessibility of primary antibodies to the antigens, but in contrast, proximity ligation assay detects protein-protein interactions with a unique technique involving rolling-circle PCR, while conventional immunocytochemistry only shows co-localization of proteins.

Nuclear factor 90 (NF90) and RNA-binding motif protein 3 (RBM3) have been previously demonstrated as interacting partners. They are predominantly localized in the nucleus, but also migrate into the cytoplasm and regulate signaling pathways in the cytoplasmic compartment. Here, we compared NF90-RBM3 interaction in both the nucleus and the cytoplasm by co-immunoprecipitation and proximity ligation assay. In addition, we discussed the advantages and limitations of these two techniques in visualizing protein-protein interactions in respect to spatial distribution and the properties of protein-protein interactions.

Introduction

Ядерный фактор 90 (NF90) является мульти-изоформы белка с многочисленными функциями , включая ответ на вирусную инфекцию, регуляции интерлейкина-2 после транскрипции и регуляции миРНК биогенеза 1-3. RBM3 представляет собой РНК-связывающий белок, участвует в переводе и микроРНК биогенеза и могут быть вызваны различными стрессорами включая гипотермию и гипоксией 4-6. В последнее время мы нашли NF90 и RBM3 в белковом комплексе 7. Взаимодействие NF90 и RBM3 имеет важное значение для модуляции РНК-как эндоплазматический ретикулум киназы (PERK) активность протеинкиназы в развернутом ответе белка 7. Оба NF90 и RBM3 расположены преимущественно в ядре , но небольшая часть NF90 и челнока RBM3 в цитоплазму и связываются там друг с другом для определенных функций, например , для регулирования Перк активности. Поэтому, важно, чтобы визуализировать распределение NF90-RBM3 взаимодействий в субклеточном отсеке, что может указывать наих различные роли в соответствующем отсеке.

Несколько десятилетий назад, был разработан дрожжи двух гибридных (Y2H) для определения взаимодействия между двумя белками 8. Тем не менее, из-за искусственной конструкции слитых белков, ложноположительных результатов ограничили применение этого метода. В течение долгого времени, со-иммунопреципитации была основным методом для анализа белок-белковых взаимодействий, особенно в условиях эндогенными 9. Для анализа со-иммунопреципитации белкового комплекса, Вестерн-блот является наиболее удобным способом, в то время как масс-спектрометрия используется, когда супер чувствительность и точность желательны. В последние годы, близость Лигирование анализ был разработан в качестве нового способа выявления белок-белковых взаимодействий в обеих клетках и тканях на месте 10,11.

Здесь мы сравнили самый популярный метод совместного иммунопреципитации и относительно новое соседство перевязки метод анализа в захвате NF90-RBM3 взаимодействие в субклеточных фракциях. Мы также обсудили преимущества и недостатки обоих методов.

Protocol

1. Со-иммунопреципитации Семенной НЕК293 в 2 х 10 5 клеток на лунку в одном 6-луночные планшеты в 2 мл модифицированной среде Игла (DMEM) добавка Дульбекко Игла с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 100 ед / мл пенициллина-стрептомицина (Pen-Strep) , Рост клеток в тече?…

Representative Results

На рисунке 1 показано , что NF90 и RBM3 являются ядерные белки и лишь небольшая часть присутствует в цитоплазме. Следует отметить, что существуют три различные полосы окрашивали позитивно для RBM3. Наименьшее чуть ниже 20 кДа отражает правильный размер RBM3 (предсказан…

Discussion

Есть несколько преимуществ, а также недостатки обоих методов. Будучи относительно новой технологии, очевидное преимущество близости лигирования анализа является возможность выяснить белок-белковых взаимодействий на уровне одной клетки, а не партии разнородных клеток. Изображения с …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Swiss National Science Foundation (SNSF, 31003A_163305).

Materials

Dulbecco's Modified Eagle’s Medium (DMEM) Sigma D6429 High glucose
4500 mg/L
Fetal bovine serum (FBS) Gibco, Thermo Fisher Scientific 10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep) BioConcept 4-01F00-H
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents Thermo Fisher Scientific 78833
1,4-Dithiothreitol (DTT) Carl Roth 6908.3
Dynabeads Protein G Novex, Thermo Fisher Scientific 10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibody BD Transduction Laboratories 612154 use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
RBM3 antibody ProteinTech 14363-1-AP use 1:1000 for WB and 1:100 for ICC/PLA
Lamin A/C antibody Cell Signaling Technology #2032 use 1:1000 for WB 
anti-GAPDH antibody Abcam ab8245 use 1:1000 for WB 
normal rabbit IgG Santa Cruz sc-2027
anti-rabbit IgG, HRP-lined secodary antiboy Cell Signaling Technology #7074 use 1:5000 for WB 
anti-mouse HRP secondary antibody Carl Roth 4759.1 use 1:5000 for WB 
Clarity Western ECL Blotting Substrate Bio-Rad #1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel Novex, Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0007
1,4-Dithiothreitol (DTT) CarlRoth 6908.1
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x) Novex, Thermo Fisher Scientific NP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membrane GE Healthcare Life Sciences 10600021
Super RX X-ray film Fujifilm 4741029230
Poly-D-Lysine 8 Well Culture Slide Corning BioCoat 354632
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148
Normal goat serum (NGS) Gibco, Thermo Fisher Scientific PCN5000
Goat anti-mouse IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11001
Goat anti-rabbit IgG (H+L Antibody), Alexa Fluor 568 conjugate Thermo Fisher Scientific A-11011
4′, 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) Sigma D9542
Duolink PLA probe Anti-mouse PLUS Sigma DUO92001
Duolink PLA  probe Anti-rabbit MINUS Sigma DUO92005
Duolink Detection Reagents Red Sigma DUO92008
Duolink Wash Buffers Fluorescence Sigma DUO82049
Duolink Mounting Medium with DAPI Sigma DUO82040
Mowiol 4-88 Sigma 81381
Microscope Olympus AX-70
CCD camera SPOT Insight 2MP Firewire
X-ray film Fujifilm Super RX
Film processing machine Fujifilm FPM-100A

References

  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication?. Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Zhu, X., Zelmer, A., Wellmann, S. Visualization of Protein-protein Interaction in Nuclear and Cytoplasmic Fractions by Co-immunoprecipitation and In Situ Proximity Ligation Assay. J. Vis. Exp. (119), e55218, doi:10.3791/55218 (2017).

View Video