Summary

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Published: January 19, 2017
doi:

Summary

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Abstract

Replikation des Genoms erfolgt während der S-Phase des Zellzyklus in einem stark regulierten Prozess, der die Genauigkeit der DNA-Vervielfältigung gewährleistet. Jede genomischen Region wird an einer bestimmten Zeit während der S-Phase durch die gleichzeitige Aktivierung mehrerer Replikationsursprünge repliziert. Zeit-Replikation (ToR) korreliert mit vielen genomischen und epigenetische Merkmale und ist mit Mutationsraten und Krebs in Verbindung gebracht. Begreifen die vollständige genomische Ansicht des Replikationsprogramm, in Gesundheit und Krankheit ist ein wichtiges Ziel für die Zukunft und Herausforderung.

Dieser Artikel beschreibt im Detail die "Copy Number Verhältnis von S / G1 zum Abbilden genomischen Zeit-Replikation" Methode (hier genannt: CNR-ToR), einen einfachen Ansatz der genomweiten ToR von Säugetierzellen abzubilden. Das Verfahren basiert auf der Kopienzahlunterschiede zwischen der S-Phase-Zellen und G1-Phasen-Zellen. 1. Herstellung von Zellen und Färbung mit Propidiumiodid (PI);: Der CNR-ToR Verfahren wird in 6 Schritten 2. Sorting G1 und S-Phasen-Zellen fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS); 3. DNA-Reinigung; 4. Ultraschall-Behandlung; 5. Bibliothek Vorbereitung und Sequenzierung; und 6. Die bioinformatische Analyse. Die CNR-ToR-Methode ist eine schnelle und einfache Ansatz, der in der detaillierten Replikation Karten führt.

Introduction

Mammalian DNA-Replikation ist streng reguliert die exakte Replikation jedes Chromosoms während des Zellzyklus genau einmal zu gewährleisten. Die Replikation erfolgt gemäß einem stark regulierten Ordnung – mehrere große genomischen Regionen (~ Mb) zu Beginn der S – Phase repliziert (frühe Domänen replizieren) , während andere Genomregionen später bei mittleren oder späten S – Phase (Mitte und Ende der replizierenden Domänen) replizieren 1. Der größte Teil des Genoms repliziert zur gleichen Zeit in allen Geweben (konstitutive ToR Domänen), während die 30% – 50% des Genoms, ändert seine ToR zwischen Geweben 2, während der Differenzierung 3, 4 und in geringerem Maße auch während der Krebstransformation 5 . Darüber hinaus sind bestimmte replizieren genomischen Regionen asynchron 6, 7, 8, nämlich ein Unterschied bestehtin den ToR zwischen den beiden Allelen.

ToR korreliert mit vielen genomischen und epigenomischen Funktionen , einschließlich der Transkription Ebenen, GC – Gehalt, Chromatinzustand, Gendichte, usw. 1, 9. ToR ist auch mit Mutationsraten und Typen zugeordnet sind 10, 11 und daher wenig überraschend, Störungen des Replikationsprogramms an Krebs 12, verbunden 13. Der kausale Zusammenhang zwischen ToR und Chromatinstruktur ist noch nicht verstanden. Es ist möglich, dass offene Chromatin frühen Replikation ermöglicht. Jedoch schlägt ein alternatives Modell , dass das Chromatin während der Replikation und die verschiedenen Chromatin – Regulatoren am Anfang und Ende der S Phasenvoreilung Verpackung Differentials der frühen und späten replizierende Regionen 1, 14 zusammengesetzt ist </sup>. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die ToR formt den GC – Gehalt durch die Art der Mutationen betreffen , die 11 in verschiedenen genomischen Regionen auftreten.

Fluoreszenz – desitu – Hybridisierung (FISH) ist die wichtigste Methode für ToR an einzelnen Loci zu messen. Es wird durchgeführt , indem einfach der Prozentsatz von S – Phasen – Zellen zu zählen , die einzelne FISH – Signale gegen den Prozentsatz der Dubletten für ein bestimmtes Allel 15, 16 aufweisen. Ein alternatives Verfahren besteht aus Impuls mit BrdU die DNA – Markierung, 17 Zellen entsprechend ihrem DNA – Gehalt zu mehreren Zeitpunkten längs S, Immunpräzipitation DNA enthält BrdU und Überprüfung der Fülle von gefällter DNA mit qPCR Sortierung.

Genomic ToR Zuordnung kann durch zwei Methoden erreicht werden. Die erste Methode ist eine genomische Version des BrdU-IP basierten oben beschriebenen Verfahren, bei dem die Quantifizierung der Mengevon gefällte DNA in jeder Fraktion wird gleichzeitig für das gesamte Genom durch Hybridisierung mit Microarrays oder durch tiefe Sequenzierung durchgeführt. Die zweite Methode, CNR-TOR, basiert die Kopienzahl jeder genomischen Region von S-Phasen-Zellen und Normalisierung durch den DNA-Gehalt in Zellen G1 zu messen. Bei diesem Verfahren werden die Zellen durch FACS in nicht-replizierenden (G1 – Phase) und Replizieren (S – Phase) Gruppen (1) sortiert. Zellen in G1 haben die gleiche Kopienzahl in allen genomischen Regionen und somit sollten ihren DNA-Gehalt gleich sein. Auf der anderen Seite hängt die DNA-Kopienzahl in S auf der ToR, seit Anfang replizierende Regionen unterzog Replikation in den meisten Zellen und wird daher ihre DNA-Gehalt verdoppelt, während spät replizierende Regionen noch nicht in den meisten Zellen repliziert wurden und damit deren DNA-Gehalt werden dem von G1-Zellen ähnlich. Daraus ergibt sich die S G1 Verhältnis von DNA-Gehalt der ToR indikativ. Die Menge an DNA für jeden genomischen Region wird entweder durch Hybridisierung gemessenMicroarrays oder durch tiefe Sequenzierung 2, 8. Die Vorteile des CNR-TOR Verfahren wird weiter diskutiert.

Dieses Papier beschreibt die CNR-ToR Verfahren zur genomischen ToR – Mapping , wie in Abbildung 2 beschrieben. Das Papier beschreibt die feinen Details des gesamten Prozesses von Zellen, bis die grundlegenden Analyse der Ergebnisse und der Erstellung von genomischen ToR Karten zu sammeln. Das Protokoll in diesem Papier beschrieben wurde auf verschiedenen Zelltypen in Kultur gezüchtet erfolgreich durchgeführt. Zukünftige Verbesserungen dieses Protokolls können in vivo zu der Abbildung des ToR führen und in seltenen Zelltypen.

Protocol

Hinweis: ToR kann nur auf das Wachstum, unsynchronisierten Zellen gemessen werden. 2 x 10 6 schnell wachsende Zellen, die in der Regel in ~ 1 x 10 5 Zellen in der S – Phase (die Rate limitierende Schritt) führt – Das Verfahren sollte mit mindestens 1 beginnen. Es wird empfohlen, jedes Experiment unter Verwendung von zwei oder drei Wiederholungen durchzuführen. Der gesamte Prozess der CNR-TOR kann innerhalb einer Woche abgeschlossen werden – 2 Tage sollten für die anfängliche Datenanalyse notwen…

Representative Results

Eine typische ToR Karte ist in Abbildung 3 für embryonalen Maus – Fibroblasten (MEF) gezeigt. Diese Figur zeigt den Analyseprozess, da es zeigt sowohl die Punkte, die die normierte S / G1-Verhältnis für einzelne Fenster (Schritt 8.3), sowie die Linie, die sich von der kubischen Glättung ergibt und Interpolation (Schritt 8.5). Solche Karten, um die Organisation des Replikationsprogramms zu erfassen, die ein…

Discussion

CNR-TOR kann im Prinzip auf jede eukaryotische proliferierenden Zellpopulation durchgeführt werden , die durch FACS zu S und G1 – Phasen (rezensiert von Rhind N. und Gilbert DM 20) unterteilt werden kann. Das hier beschriebene Verfahren hat sich an Säugerzellen mit einer Genomgröße von ~ 3 Gb wie Mensch und Maus angepasst. Kleine Änderungen in der CNR-TOR-Protokoll (in Zellpräparation und Sequenzierung Tiefe) werden benötigt, um es an andere Eukaryoten einzustellen. Es ist auf die Sammlung…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Orija Vardi für die Unterstützung in Zahlen zu erzeugen. Die Arbeit in der IS-Gruppe wurde von der Israel Science Foundation (Zuschuss Nr 567/10) und des European Research Council Starting Grant (# 281306) unterstützt.

Materials

PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15ml conical tube Corning 430790
5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10mg/ml Sigma R4875
Propidiom iodide 1mg/ml Sigma P4170
parafilm Parafilm PM-996
1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7ml MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads – Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis.2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing – Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

References

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Citer Cet Article
Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

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