Взрослых Drosophila мозг является ценным система для изучения нейронной цепи, высшие функции мозга, и сложные расстройства. Эффективный метод рассекать всю мозговую ткань от маленькой головы летучей будет способствовать мозга на основе исследования. Здесь мы опишем простой, один шаг рассечение протокол мозга взрослого человека с хорошо сохранившейся морфологии.
Существует растущий интерес к использованию дрозофилы для моделирования мозга дегенеративных заболеваний человека, карта нейронные схемотехника в взрослом мозге, и изучение молекулярной и клеточной основы высших функций мозга. Препарат целого монтирование мозга взрослого человека с хорошо сохранившейся морфологии имеет решающее значение для таких всего головного мозга на основе исследований, но может быть технически сложным и занимает много времени. Этот протокол описывает простой в освоении, один шаг рассечение подход головки взрослых мух менее чем за 10 секунд, сохраняя при этом неповрежденный мозг, прикрепленный к остальной части тела, чтобы облегчить последующие этапы обработки. Процедура помогает удалить большую часть глаза и трахеи тканей, обычно связанные с мозгом, который может повлиять на более позднем этапе формирования изображения, а также места, меньший спрос на качество рассекает щипцов. Кроме того, мы опишем простой метод, который позволяет удобно листать смонтированных образцов мозга на покровное, что очень важно для работы с изображениями с обеих сторон бдожди с аналогичной интенсивности и качества сигнала. В качестве примера протокола, мы представим анализ дофаминергических (DA) нейронов в головном мозге взрослых WT (вес 1118) мух. Высокая эффективность метода рассечение делает его особенно полезным для крупномасштабных исследований мозга взрослых на основе у дрозофилы.
Модель организма дрозофилы, широко известный как дрозофилы, уже давно ценится за его изящными генетических инструментов, короткие репродуктивные времена, и высоко консервативны молекулярных и клеточных путей. Плодовая муха была успешно использована для рассекают основных сигнальных путей, структурирование механизмы многоклеточных организмов, а также механизмы , лежащие в основе развития нейронов, функции и заболевания 1,2. С учетом последних достижений в области маркировки клеток и визуализации технологий, плодовая мушка мозг стал особенно мощным в тонкой отображения нейронной цепи и в рассекает молекулярной и клеточной основы высших мозговых функций, таких как обучение и память, и циркадный ритм 1,3, 4,5,6,7,8.
Одним особым преимуществом системы Drosophila является его относительно небольшой размер, что позволяет целом монтажа подготовку и обследование головного мозга с помощью обычного соединения или конфокальной микроскопии. Тхиs функция позволяет подробные анатомические и функциональный анализ нейронной цепи, или даже один нейрон, на клеточном и субклеточном уровнях, в контексте всей ткани мозга, таким образом, обеспечивая как целостный взгляд на исследуемый объект и его точную геометрию в целом головной мозг. Однако, учитывая довольно миниатюрные размеры мозга, он также представляет собой сложную техническую задачу в эффективно рассекает неповрежденный ткани мозга из защитного экзоскелет головки случае во взрослой мухи. Различные эффективные и относительно простые методы рассечение были описаны подробно, которые обычно включают тщательное и ступенчатые удаление корпуса головки и связанные с ним ткани и глаза, трахеи, и жир из мозга надлежащего 9, 10. Эти микрохирургические методы рассечение часто устанавливают достаточно жесткие требования к качеству диссекции пинцетом, опираясь на щипцов с прекрасными хорошо выровненных советов, которые могут быть легко повреждены. Более того, как рассеченные мозг часто separatред от остальной части тела, мозг может быть легко потеряны во время последующих окрашивания и моечных процессов из-за их малых размеров и их прозрачности в буфере обработки. Здесь мы описываем относительно простой и легкий в освоении, один шаг протокол рассечение для мозга взрослого человека, который держит расчлененный мозги, прикрепленные к туловищу. Процесс рассечение часто легко убирает большую часть мозга ассоциированных тканей, таких как глаз и трахеи и снижает спрос на хорошее качество рассечение щипцов.
Кроме того, при визуализации мозга под флуоресцентным микроскопом или составного конфокальный микроскоп, сторона мозга, который находится вдали от флуоресцентного источника света часто дает более слабый сигнал и менее четкие изображения из-за толщины мозга целом монтажа. Здесь мы также опишем простой способ установки, позволяющий легко листать образцов мозга, что позволяет удобно визуализации обеих сторон мозга с аналогичным сигналом Intensiти и качества.
В качестве доказательства правильности концепции для применения этого метода для изучения мозга взрослого человека, мы исследовали далее присутствие DA нейронов в мозге W 1118 мух; генотип , который часто используется в качестве родительской линии для получения трансгенных мух и контроль дикого типа во многих исследованиях Drosophila.
С ростом интереса с помощью взрослых дрозофилы мозга для изучения заболеваний головного мозга человека, нейронной цепи, и высшие функции мозга, необходимо разработать простые и быстрые методы , чтобы получить неповрежденные летать мозги для всего-монтировки анализы, что особенно…
The authors have nothing to disclose.
Мы признаем, г-н EnEs Mehmet, г-жа Kiara Андраде, г-жа Пилар Родригес, Крис Квок, и г-жу Danna сура гафир за их огромную поддержку проекта.
w*; parkΔ21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51652 | Balancer was switched to TM6B |
PBac{WH}parkf01950 | Exelixis at Harvard Medical School | f01950 | Balancer was switched to TM6C |
NaCl | Fisher Scientific | S640-500 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-003-990 | |
Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
Sodium phosphate, monobasic monohydrate (NaHCO3) | Fisher Scientific | 02-004-198 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | 02-003-265 | |
D-Sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876-500G | Replaces glucose |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
EMD Millipore Durapore PVDF Membrane Filters: Hydrophilic: 0.22µ Pore Size | Fisher Scientific | GVWP14250 | |
Formalin Solution, 10% (Histological) | Fisher Scientific | SF98-20 | |
Potassium Phosphate, Dibasic, Powder, Ultrapure Bioreagent | Fisher Scientific | 02-003-823 | |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
Excelta Precision Tweezers with Very Fine Points | Fisher Scientific | 17-456-055 | Protocol does not require very fine points. |
Anti-Tyrosine Hydroxylase Antibody | Pel-Freez Biologicals | P40101 | |
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav | The Developmental Studies Hybridoma Bank | Clone 7E8A10 | |
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-21247 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate | ThermoFisher Scientific | A-11037 | |
DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
Propyl gallate powder | Sigma-Aldrich | P3130-100G | |
Glycerol ACS reagent, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | G7893-500ML | |
Zeiss Axioimager Z1 | Zeiss | Quote | |
Zeiss Apotome.2 | Zeiss | Quote | |
Zen lite software | Quote |