מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג'ין<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
אנו מתארים כאן שלושה פרוטוקולים שונים לחקירה במבחנה של נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי Staphylococcus aureus.
Abstract
תכונה חשובה אחת של הפתוגן האנושי אופורטוניסטים הגדול Staphylococcus aureus היא היכולת יוצאת הדופן שניתן לה לרכישת התנגדות במהירות לאנטיביוטיקה. מחקרים הגנום עולים כי S. aureus שנושא גנים ארסיים והתנגדות רבים הנמצאים אלמנטים גנטיים ניידים, דבר המצביע על כך העברת גנים אופקית (HGT) ממלאת תפקיד קריטי באבולוצית aureus S.. עם זאת, תיאור מלא ומפורט של המתודולוגיה ששימשה ללמוד HGT ב S. aureus עדיין לוקה בחסר, במיוחד לגבי השינוי הטבעי, אשר דווחה לאחרונה החיידק הזה. עבודה זו מתארת שלושה פרוטוקולים מועילים לחקירה חוץ גופייה של HGT ב S. aureus: הנטייה, תמרה הפאג, וטרנספורמציה טבעי. למטרה זו, הגן CFR (chloramphenicol / התנגדות florfenicol), אשר מקנה את Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, ו Streptogramin A (PhLOPSא) -resistance פנוטיפ, היה בשימוש. הבנת המנגנונים שבאמצעותם S. aureus מעבירה חומרים גנטיים זנים אחרים היא חיונית כדי להבין את הרכישה המהירה של התנגדות ומסייעת להבהיר את דרך ההפצה דיווחה בתוכניות מעקב או להמשיך לחזות את מצב ההפצה בעתיד.
Introduction
Staphylococcus aureus הוא חיידק commensal חיובי-גראם שבאופן טבעי שוכנת חלל עור אף של בני אדם ובעלי חיים. מינים של חיידקים זהו הגורם העיקרי להיווצרות זיהומים הנרכשים בבית חולים בבתי חולים והגדרות בריאות. יתר על כן, יכולתה לפתח עמידות תרכובות מיקרוביאלית שונות הפכה הנהלת הזיהומים הנגרמים על ידי חיידק זה לתוך דאגה עולמית.
שני מסלולים עיקריים מעורבים בהפצת פנוטיפים התנגדות ידועים: הפצת המשובטים של גנוטיפים עמידים בהפצת גורמים גנטיים בין ברכת החיידקים. במקרה של S. aureus, גנים עמידים לאנטיביוטיקה שונה (כמו גם גורמים ארסיים) נמצא להיות מזוהה עם אלמנטים גנטיים ניידים (MGEs) 1. הנוכחות של אלמנטים אלה בגנום של S. aureus מציינת כי הרכישה והעברת genחומר etic בתוך אוכלוסיית חיידקי יכול לשחק תפקיד חשוב עבור הסתגלות ואבולוציה aureus S..
ניתן להחליף חומר גנטי באמצעות מנגנוני שלושה ידועים של HGT בחיידקים החיוביים גראם: טרנספורמציה, נטייה, תמרה הפאג. טרנספורמציה כרוך את הספיגה של DNA החופשי. כדי לרכוש דנ"א זר, תאי חיידקיים צריכים לפתח שלב פיסיולוגי מיוחד: שלב היכולת. כאשר בשלב זה הוא הגיע, תאי מוסמכות מסוגלים הובלת DNA לתוך הציטופלסמה, רכישת גורמים גנטיים חדשים. במקרה של S. aureus, קיומו של שינוי טבעי הודגם 2 לאחרונה. בקנה אחד עם זה, הקבוצה שלנו לשפוך אור על הרלוונטיות של הביטוי של גורם אנחה (גורם סיגמא שעתוק משני נסתר) בשלב סמכותה של פיתוח על איך ביטוי המכונן שלה הופך S. aureus מסוגל מגששתg לשלב יכולת, המאפשר לרכישת פנוטיפים עמיד ידי טרנספורמציה טבעית 2.
הצמדתי הוא תהליך המערב את העברת הדנ"א מתא בית מגורים אחד (תורם) למשנו (נמען). תאי השני חייבים להיות בקשר ישיר, המאפשרים DNA שיוחלף בעוד מוגן על ידי מבנים מיוחדים, כגון צינורות או נקבובי. העברת ה- DNA על ידי שיטה זו דורשת מנגנון conjugative. ב S. aureus, הפלסמיד אבטיפוס conjugative הוא PGO1, אשר מטפח את אופרון TraA 3 conjugative.
תמרת הפאג כרוכה בהעברת DNA מתא לתא דרך הזיהום בקטריופאג ורומזת לאריזת DNA בקטריאלי, במקום ה- DNA הנגיפי, לתוך קפסיד הפאג. רוב הבידודים S. aureus הם lysogenized ידי bacteriophages 1. עם בתנאי עקה, ניתן נכרת prophages מן genom חיידקידואר ולעבור מחזור ממס.
אלה הם המנגנונים השלושה ידועים שידור DNA ב S. aureus. ישנם כמה מנגנוני העברה נוספים, כגון "פסאודו-טרנספורמציה" 2 ומערכות דמויות הפאג בהעברת האיים פתוגניות 4. לאחרונה, קבוצה אחת דיווחה כי "צינורות" מעורבים בהעברת חומרים הסלולר (כולל DNA פלסמיד) בין תאים שכנים 5, 6, אך מחקר מעקב לא הופיע מקבוצות אחרות עד כה.
עבודה זו מספקת את המתודולוגיה צורך ללמוד HGT ב S. aureus ידי טיפול השלושה מסלולי העברה עיקריים: נטייה, תמרה, וטרנספורמציה טבעי. התוצאות שהושגו עם מתודולוגיות אלה שימשו ללמוד את העברת הגן CFR (התנגדות chloramphenicol / florfenicol) ביןS. aureus זני 7. טכניקות שלוש אלה הן כלים צדדיים לחקירת שידור MGE ב S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת שלוש השיטות העיקריות ללמוד את HGT של גורמים גנטיים ב S. aureus. למרות התמרה והזדווגות נחקרו במשך עשרות שנים, את קיומו של שינוי טבעי היה רק לאחרונה מוכר 2. לפיכך, S. aureus מצויד בכל אחד משלושה המצבים הגדולים של HGT, ובדיקת כולם נדרשה להבהיר …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
