LC-MS / MS 분석을 이용하여 핵 공동 인자와 상호 작용 단백질의 높은 처리량 식별 단백질 제조 방법
Summary
우리는 LC-MS / MS 시스템을 사용 coregulatory 상호 작용 단백질의 정제 방법을 확립 하였다.
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
단백질 – 단백질 상호 작용은 다양한 생물학적 기능에 중요한 역할을한다. 따라서, 이러한 상호 작용은 신호 전달에 연루되어왔다 세포막 단백질 수송; 세포의 신진 대사; 및 DNA 복제, DNA 손상 복구, 재조합 및 전사 1, 2, 3, 4 등 여러 핵 프로세스. 이러한 상호 작용에 관여하는 단백질을 확인하는 것은이 세포 과정에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요하다.
면역 침전 (IP)는 단백질 – 단백질 상호 작용을 분석하는데 사용되는 검증 된 기술이다. 공동 – 면역 침전 된 단백질의 동정을 용이하게하기 위하여, 질량 분석계는 종종 이용 5, 6, 7, 8,9. 항체와 단백질 복합체의 공지 부재 타겟팅함으로써, 단백질 복합체를 분리하고,이어서 질량 분광 분석을 통해 그 미지의 컴포넌트를 식별 할 수있다. ARIP4 (안드로겐 수용체 상호 작용하는 단백질 4), 전사 coregulator은 활성화 또는 상황에 의존적으로 9, 10 년 대상 발기인을 억제하기 위해 핵 수용체 단백질과 상호 작용한다. 더 이러한 핵 인자를 지배하는 전사 조절 메커니즘을 이해하기 위해 정화하고, LC-MS / MS 시스템을 사용하여 ARIP4 상호 작용 단백질을 확인하는 포괄적 인 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
효율적인 형질 감염 프로토콜이 성공적인 결과를 얻는 것이 필수적이다. 따라서, 우리는 면역 FLAG 태그가 단백질 수준을 결정하는 웨스턴 블롯 분석을 사용하는 것이 좋습니다. 이 단계는 IP가 성공적으로 수행되었는지, 그들의 관심 단백질이 제대로 또한, 과발현되어 있는지 확인하려면 사용자 수 있습니다. FLAG 태그가 단백질 수준은 질량 분광 분석에 앞서 확인하여야한다.
…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
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