Ein Protein Herstellungsverfahren für die Hochdurchsatz-Identifizierung von Proteinen Interagieren mit nuklearen Cofaktor LC-MS / MS-Analyse
Summary
Wir haben ein Verfahren zur Reinigung von Koregulierung Wechselwirkung Proteine etabliert unter Verwendung der LC-MS / MS-System.
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
Protein-Protein-Wechselwirkungen spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Funktionen. Als solche haben diese Wechselwirkungen wurden in Signaltransduktion in Verbindung gebracht; Proteintransport durch Zellmembranen; Zellstoffwechsel; und mehrere Kernprozesse, einschließlich der DNA – Replikation, DNA – Schäden zu reparieren, Rekombination und Transkription 1, 2, 3, 4. Identifizierung der Proteine in dieser Wechselwirkungen beteiligt ist daher von entscheidender Bedeutung, unser Verständnis dieser zellulären Prozesse voranzutreiben.
Immunopräzipitation (IP) ist eine validierte Technik verwendet, um Protein-Protein-Interaktionen zu analysieren. Ist , um die Identifizierung von co-immunpräzipitiert Proteine, Massenspektrometrie häufig 5 verwendet zu erleichtern, 6, 7, 8,9. ein bekanntes Mitglied einer Protein-Komplex mit einem Antikörper von Targeting ist es möglich, den Proteinkomplex zu isolieren und seine unbekannten Komponenten über Massenspektrometrie-Analyse, um anschließend zu identifizieren. ARIP4 (Androgen – Rezeptor-interacting protein 4), eine Transkriptions coregulator, in Wechselwirkung mit der Kernrezeptorproteine, um seine Zielpromotoren in einer kontextabhängig 9, 10 zu aktivieren oder zu unterdrücken . ARIP4 interagierende Proteine mit Hilfe der LC-MS / MS-System, um besser auf die Transkriptionsregulationsmechanismen verstehen diese Kernfaktoren regeln, beschreiben wir ein umfassendes Verfahren zur Reinigung und zu identifizieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effiziente Transfektion ist wichtig, ein erfolgreiches Ergebnis mit diesem Protokoll zu erhalten. Dementsprechend empfehlen wir Western-Blot-Analyse unter Verwendung der immunpräzipitierten FLAG-markierten Protein-Spiegel zu bestimmen. Dieser Schritt ermöglicht es Benutzern, zu überprüfen, ob ihre Protein von Interesse richtig überexprimiert und darüber hinaus, dass die IP wurde erfolgreich durchgeführt. FLAG-markierte Proteinspiegel sollte auch vor der Massenspektrometrie-Analyse überprüft werden.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
References
- De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807 (2010).
- Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
- MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
- Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
- Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
- Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
- Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
- Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430 (2013).
- ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics – the user’s guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
- Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
- Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498 (2015).
- Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
- Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
- Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D’Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
- Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).
