Uma proteína Método de Preparação para a Identificação de alto rendimento de proteínas que interagem com um co-fator nuclear utilizando LC-MS / MS Análise
Summary
Nós estabelecemos um método para a purificação de proteínas de interacção co-regulação que utilizam o sistema de LC-MS / MS.
Abstract
Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.
Introduction
interacções proteína-proteína desempenham um papel importante em muitas funções biológicas. Como tal, estas interacções têm sido implicados na transdução de sinal; transporte de proteínas através das membranas celulares; metabolismo celular; e vários processos nucleares, incluindo a replicação do ADN, reparação de danos do ADN, a recombinação e a transcrição 1, 2, 3, 4. Identificar as proteínas envolvidas nestas interacções é, portanto, fundamental para o avanço da nossa compreensão destes processos celulares.
A imunoprecipitação (IP) é uma técnica validado e utilizado para analisar interacções proteína-proteína. A fim de facilitar a identificação de proteínas co-imunoprecipitada, a espectrometria de massa é frequentemente utilizada 5, 6, 7, 8,9. Ao direccionar um membro conhecido de um complexo de proteína com um anticorpo, é possível isolar o complexo de proteína e, subsequentemente, para identificar os seus componentes desconhecidos através de análise de espectrometria de massa. ARIP4 (proteína-receptor de androgénio interagindo 4), um coregulator transcricional, interage com as proteínas nucleares do receptor, a fim de activar ou reprimir seus promotores-alvo de uma forma dependente do contexto 9, 10. Para melhor compreender os mecanismos reguladores da transcrição que regulam estes factores nucleares, nós descrevemos um método global para purificar e identificar proteínas que interagem ARIP4 usando o sistema de LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
transfecção eficiente é essencial para obter um resultado bem sucedido com este protocolo. Assim, recomendamos o uso de análise de Western blot para determinar os níveis de proteína FLAG-marcadas imunoprecipitadas. Esta etapa permite que os usuários para verificar se a sua proteína de interesse é adequadamente overexpressed e, além disso, que o IP foi realizada com sucesso. Os níveis de proteína marcada com Flag também deve ser verificado antes da análise por espectrometria de massa.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x) | nacalai tesque | 03969-21 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Micro Bio-Spin Columns | BIO-RAD | 732-6204 |
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